甲基异柳磷半抗原、完全抗原、抗体及制备方法和应用

本发明属于甲基异柳磷检测，具体涉及一种甲基异柳磷半抗原、完全抗原、抗体及制备方法和应用。

背景技术：

1、我国是农药生产和使用大国，农药的使用给农业创造了经济效益，同时农药残留也造成了环境污染和食品安全等诸多问题。不仅是农业，中药材产业方面也存在同样问题。随着我国经济的高速发展，人们对健康的日益重视推动着中药资源的需求量日益增加；越来越多的人工种植中药材成为中药材的主力军。但因为一些原因，农药残留污染问题在当前中药材生产中较为突出，并且中药农药残留问题已在很大程度上影响了我国中药的出口。因此国家加强了对中药农药残留的检测要求；2020版《中国药典》中要求33种农残必检，这其中就包括甲基异柳磷。

2、甲基异柳磷（isofenphos-methyl）属于土壤有机磷杀虫剂，化学名为0-甲基-o-[(2-异丙氧基甲酰)苯基]-n-异丙基硫代磷酰胺或o-(甲氧基-n-异丙基氨基硫代磷酰基)水杨酸异丙酯。它杀虫广谱、残效期长，是防治地下害虫的优良药剂，可防治蛴螬、蝼蛄、地老虎、金针虫等，也可用于防治黏虫、蚜虫、烟青虫、桃小食心虫、红蜘蛛等。其具有较强的触杀、胃毒及内吸作用，是目前我国限制使用的高毒性农药之一。甲基异柳磷对人畜口服毒性与甲胺磷相近，皮肤接触毒性比甲胺磷高4到5倍。因此，除加强对甲基异柳磷的使用管理，从源头控制的同时，还应加强对其的检测与监管。

3、目前，检测农药，包括甲基异柳磷残留的方法主要有高效液相色谱法((hplc)、气相色谱法((gc)、气－质联用法（gc-ms）、液－质联用法((hplc-ms)等。这些检测方法的优点是准确率和灵敏度高、稳定性和重复性好；不足之处是需要复杂精密且昂贵的仪器设备、检测成本高，检测时间长、步骤多，对操作人员技术要求高、对样本前处理要求高，对环境不友好、不适合现场或批量检测等；这使得其不适合于快速的、大规模的检测以及从生产到销售各环节的现场检测。而基于抗原抗体特异性结合反应的免疫分析法，具有操作简单、快速、灵敏度高、检测成本低，并且适于现场或实验室进行大批量检测的优点，在农药残留检测中具有广阔的应用前景。

4、常见的免疫检测方法有有elisa、侧向免疫层析等等。尽管免疫分析用于农药残留分析的时间较短，但其检测速度快、成本低、对样本要求不高，可在中药材种植、收获、生产加工、销售等各个环节进行现场快速检测等优点，使其对于提高中药材品质，保证患者健康和突破中药出口瓶颈，有着极大的推动意义。

5、免疫分析法的前提是合适的抗原和特异性抗体的制备。甲基异柳磷分子量为331，是典型的小分子化合物，半抗原；且其本身不含有可供偶联的功能基团，必须进行分子改造或半抗原合成，获得带有可偶联基团（常见的为羧基或氨基，以羧基更为常用）的甲基异柳磷分子改造物或类似物半抗原，再与载体蛋白以共价键偶联形成完全抗原，用于抗体制备和后续的免疫分析。目前已有的甲基异柳磷羧基化半抗原制备方法为以水杨酸异丙酯和o-甲基硫代磷酰二氯为起始原料，经过多步反应、分离纯化中间产物、再反应等过程合成带有羧基的甲基异柳磷分子类似物。以专利申请号为201911088614.9为例，其合成过程为：

6、1. 取水杨酸异丙酯2.9 g溶于乙腈；常温下将其滴入20 ml乙腈溶解的3.84 g o-甲基硫代磷酰氯和8.7 g k2co3中，滴完继续反应1 h。

7、2. 真空过滤，蒸去溶剂，得到的黄色油状物，经柱层析，再用石油醚/二氯甲烷洗涤。

8、3. 蒸去溶剂，得到黄色油状液体，取1.18 g该液体溶于6 ml甲醇备用。

9、4. 取0.54 g 4-氨基丁酸、0.78 g koh，溶于6 ml甲醇中，冰浴至0-10 ℃。

10、5. 搅拌下缓慢将3所制黄色油状物的甲醇溶液加入到4中，保温反应2h。

11、6. 以石油醚/二氯甲烷洗涤，水层调ph=3.0后，用乙醚提取。

12、7. 无水硫酸钠干燥，蒸去溶剂，得到浅黄色油状物o-(甲氧基-n-丁酸基硫代磷酸酰基)水杨酸异丙酯，即为半抗原。

13、然而这种方法的缺点为：一是产物虽然加上一个羧基，同时也使得其与甲基异柳磷分子相比“损失”了一个游离甲基，这个甲基的缺失对抗原空间结构，抗体识别和结合，以及降低制备的检测试剂与其他类似农药的交叉反应等情况存在潜在不利影响；二是合成步骤多，过程复杂，反应条件和装置要求相对较高，产物纯化过程相对复杂等，也因此该反应要用到的化学试剂的量相对要多。对于非化学实验室或生产单位来说实现起来较为困难。

技术实现思路

1、本发明的目的在于针对现有技术存在的上述问题，提供一种新的甲基异柳磷半抗原、完全抗原、抗体及制备方法和应用。所述的甲基异柳磷半抗原尽可能的保留了甲基异柳磷分子结构且制备工艺简单。

2、本发明的第一目的，提供一种甲基异柳磷半抗原，其具有式ⅰ所示的结构：

3、

4、式ⅰ；

5、其中，m为1-3的整数。

6、本发明的第二目的，提供前述的甲基异柳磷半抗原的制备方法，包括如下步骤：

7、（1）将甲基异柳磷和二酸酐混合于溶剂中使反应，完成后得到混合反应液；

8、（2）将所述混合反应液干燥，以超纯水萃取，得到第一水相；

9、（3）将所述第一水相以二氯甲烷萃取，得到第二水相，再进行干燥，得到甲基异柳磷半抗原。

10、优选的，步骤（1）中，二酸酐选自丁二酸酐、戊二酸酐或己二酸酐；所述的溶剂为吡啶；所述的甲基异柳磷和二酸酐的摩尔比为1:1；基于提高反应效率，缩短反应时间，还可以加入催化剂，所述的催化剂为4-二甲氨基吡啶或4-吡咯烷基吡啶；所述反应的温度为4~80℃，进一步优选为56℃反应5h；

11、优选的，步骤（2）中，将所述混合反应液采用氮气吹干，再以等体积4℃预冷的超纯水萃取，得到第一水相；

12、优选的，步骤（3）中，将所述第一水相以等体积二氯甲烷萃取，得到第二水相，再采用氮气吹干，得到甲基异柳磷半抗原。

13、本发明的反应原理为，以甲基异柳磷和二酸酐为原料在催化剂作用下，在吡啶中反应，二酸酐开环，一端和甲基异柳磷分子上的亚氨基发生氨解反应形成酰胺键，另一端接受亚氨基上的氢形成羧基。

14、本发明合成的甲基异柳磷半抗原结构：甲基异柳磷分子上的亚氨基与开环的二酸酐形成酰胺键，原二酸酐成为合成半抗原的一条侧链，链的游离端为羧基。侧链碳原子数可为4、5或6。合成的半抗原分子量为甲基异柳磷分子量和二酸酐分子量之合。

15、本发明的第三目的，提供一种甲基异柳磷完全抗原，其是前述的甲基异柳磷半抗原与载体蛋白的偶联物。优选的，所述的载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白或血蓝蛋白。本发明提供的完全抗原，为建立甲基异柳磷免疫检测技术提供了良好的前提物质基础。

16、本发明的第四目的，提供前述的甲基异柳磷完全抗原的制备方法，其包括如下步骤：

17、（1）取一定量甲基异柳磷半抗原溶于有机溶剂中，边搅拌边加入等摩尔的偶联剂，避光活化10-16h，再离心，取上清，得到活性酯；

18、（2）将载体蛋白溶于ph=9.0的碳酸盐缓冲液中，搅拌下将步骤（1）得到的活性酯滴入载体蛋白溶液，滴完继续搅拌5-10h；

19、（3）将步骤（2）所得液体离心取上清，用超纯水透析，再经冻干即得。

20、优选的，所述的偶联剂为二环己基碳二亚胺和n-羟基丁二酰亚胺；和/或，所述的溶剂为n,n-二甲基甲酰胺；和/或，所述的活性酯和载体蛋白的摩尔比为50-150:1。

21、本发明的第五目的，提供一种甲基异柳磷抗体，其是由前述的甲基异柳磷完全抗原经动物免疫得到。

22、本发明的第六目的，提供前述的甲基异柳磷抗体在用于包括但不限于免疫检测中药材甲基异柳磷残留中的应用，如侧向免疫层析检测、elisa、放射免疫检测等。

23、本发明的有益效果为：

24、本发明提供的以甲基异柳磷和酸酐为主要原料，制备甲基异柳磷半抗原的方法，提供了一种新的甲基异柳磷羧基化半抗原制备方法，与现有其他制备方法相比，具有以下优点：1）制备工艺方面：反应试剂种类和用量少、合成过程简单（只需一步反应）、反应条件要求低（普通ep管中即可进行，4-80℃范围均可，无需回流等）、产物分离纯化简单（只需简单2步萃取）；2）产物方面：制备的甲基异柳磷半抗原尽可能的保留了甲基异柳磷分子结构，并且未在甲基异柳磷主结构上增加或减少基团，有利于提高所得甲基异柳磷半抗原分子在抗原性、以之制备的抗体对甲基异柳磷的特异性以及免疫检测试剂的灵敏度和特异性。