一种分泌抗三种赭曲霉毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

本发明涉及一种分泌抗三种赭曲霉毒素广谱性单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，适用于包括赭曲霉毒素a、赭曲霉毒素b、赭曲霉毒素c在内的三种真菌毒素的现场快速筛查，属于真菌毒素快速检测领域。

背景技术：

1、赭曲霉毒素主要由一些青霉属和曲霉属物种产生，是目前已知的400多种真菌毒素中极为重要的一类。赭曲霉毒素家族主要由赭曲霉菌毒素a(ota)、赭曲毒素b(otb)和赭曲霉毒素c(otc)组成。otb是ota的脱氯衍生物，而otc是ota的乙酯衍生物。其中，ota最为常见，在各种食品中被检测到，如葡萄、谷物、咖啡、茶、牛奶、鱼、家禽、鸡蛋、豆类和动物饲料等。此外，多种赭曲霉毒素共同污染食品也被报道，如高粱中同时检出ota和otb以及葡萄酒中同时检出ota、otb和otc。除了污染食品外，ota近年来也经常在草药中被检测到，在世界范围内引起了极大关注。

2、研究表明赭曲霉毒素具有多种毒性作用，包括肾毒性、肝毒性、致畸性、诱变性、免疫毒性和神经毒性。ota被国际癌症研究机构划分为2b类致癌物，otc的毒性与ota相似或弱于ota，而otb的毒性低于ota和otc。鉴于赭曲霉毒素在食品和草药中痕量和普遍存在，且三种赭曲霉毒素之间可以互相转化，亟需建立方便、快速和灵敏的方法同时检测三种赭曲霉菌毒素。

3、传统的赭曲霉毒素测定方法包括薄层色谱(tlc)、高效液相色谱-荧光检测器(hplc-fld)和液相色谱-串联质谱(lc-ms/ms)等。这些传统方法具有较高的灵敏度、准确性和重现性，但操作复杂、设备昂贵、成本高、步骤耗时，不适合大量样品的快速现场筛选。近年来，基于抗体-抗原识别的免疫分析法已成为快速、灵敏检测赭曲霉毒素的新方法。抗体是开发免疫分析方法的核心要素，决定了其检测分析物的灵敏度和特异性。目前，已报道的抗赭曲霉毒素单克隆抗体大多只能检测一种赭曲霉毒素，而与其它两种毒素具有较低的交叉反应率。因此，制备一种抗三种赭曲霉毒素广谱性单克隆抗体尤为必要。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种分泌抗三种赭曲霉毒素广谱性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并基于该细胞株分泌的单克隆抗体开发免疫层析试纸条检测方法，可用于中药复杂基质中三种赭曲霉毒素高灵敏快速同时检测。该方法具有操作方便、成本低、时间短、肉眼可见等优势，适用于赭曲霉毒素现场大量筛查，具有广阔的应用前景。

2、本发明获得了能够产生特异性识别三种赭曲霉毒素的广谱性单克隆抗体的杂交瘤细胞株a7g8，此细胞株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmcc no.45336，保藏日期为2022年12月8日；此外，本发明通过合成包被抗原，建立了免疫层析试纸条检测方法用于三种赭曲霉毒素的现场高灵敏度快速筛查。

3、技术方案：

4、1.抗三种赭曲霉毒素的杂交瘤细胞株a7g8，保藏编号为cgmcc no.45336。

5、2.抗三种赭曲霉毒素的广谱性单克隆抗体，由保藏号为cgmcc no.45336的杂交瘤细胞株所分泌。

6、3.本发明提供的a7g8杂交瘤细胞株的基本制备及其应用包括如下步骤：

7、(1)人工抗原合成与鉴定：

8、将1.14mg的nhs，2.0mg的ota和4.09mg的dcc溶解在1.0ml的无水四氢呋喃中，于室温下避光缓慢振摇过夜，8000r/min离心15min，取上清液氮吹干燥，加入0.5ml n，n-二甲基甲酰胺复溶，即为活化产物。称取15mg bsa和10g ova分别溶解于2ml 0.13mol/l nahco3溶液中，将活化产物缓慢滴加于bsa和ova溶液中，室温避光缓慢振摇4h。反应产物在0.01mol/l的pbs溶液中透析72h，离心去沉淀，即得免疫抗原ota-bsa和包被抗原ota-ova；

9、(2)小鼠免疫：

10、将制备好的免疫抗原ota-bsa用于免疫6周的balb/c雌性小鼠，以100μg/次给每只小鼠腹腔及背部皮下注射免疫原，每两周免疫一次，共免疫四次，取小鼠眼眶血，采用间接elisa法检测血清效价和抑制率；

11、(3)细胞融合和细胞株筛选：

12、筛选出血清效价最高且抑制最好的免疫小鼠，细胞融合前三天腹腔注射100μg免疫原进行冲击免疫。采用peg法将免疫小鼠的脾细胞与培养的sp2/0骨髓瘤细胞以3∶1～10∶1的比例进行融合。所获杂交瘤细胞在96孔培养板中在二氧化碳培养箱中37℃培养，10天后采用间接非竞争elisa法检测上清进行筛选。筛选抑制最好的阳性细胞株进行四次亚克隆，最终获得杂交瘤细胞株a7g8，杂交瘤细胞株送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为cgmcc no.45336；

13、(4)抗体制备及应用

14、将杂交瘤细胞株cgmcc no.45336注射到小鼠腹腔制备腹水，10天后取腹水，将腹水纯化后冻干，即得单克隆抗体。基于杂交瘤细胞株cgmcc no.45336分泌的抗三种赭曲霉毒素广谱性单克隆抗体制备免疫层析试纸条，用于中药复杂基质中赭曲霉毒素的快速检测。

15、本发明的有益效果是：

16、本发明通过合成的ota-bsa人工抗原免疫balb/c雌性小鼠，制备了一株分泌抗三种赭曲霉毒素广谱性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，基于该细胞株制备了高灵敏度的抗三种赭曲霉毒素广谱性单克隆抗体，以ota-ova人工抗原作为检测抗原，建立了免疫层析试纸条检测方法，能高灵敏度同时检测ota、otb和otc三种真菌毒素，该方法灵敏度高、操作方便、成本低、时间短，可用于食品及中药中赭曲霉毒素的高灵敏现场快速大量筛查。

17、保藏说明：

18、参据的生物材料(株)：a7g8

19、科学描述：小鼠杂交瘤细胞株

20、保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

21、保藏机构简称：cgmcc

22、地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

23、保藏日期：2022年12月8日

24、藏中心登记入册编号：cgmcc no.45336

技术特征：

1.一种分泌抗三种赭曲霉毒素广谱性单克隆抗体的杂交瘤细胞株a7g8，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.45336，其特征在于：所述杂交瘤细胞株是通过赭曲霉毒素a(ota)人工抗原与牛血清白蛋白(bsa)偶联得到免疫抗原后免疫雌性balb/c小鼠制备并筛选得到的。所述ota人工抗原的合成方法为：将1.14mg的nhs，2.0mg的ota和4.09mg的dcc溶解在1.0ml的无水四氢呋喃中，于室温下避光缓慢振摇过夜，8000r/min离心15min，取上清液氮吹干燥，加入0.5ml n，n-二甲基甲酰胺复溶，即为活化产物。称取15mg bsa溶解于2ml 0.13mol/l nahco3溶液中，将活化产物缓慢滴加于bsa溶液中，室温避光缓慢振摇4h。反应产物在0.01mol/l的pbs溶液中透析72h，离心去沉淀，即得免疫抗原ota-bsa。

2.一种抗三种赭曲霉毒素广谱性单克隆抗体，其特征在于：它是由权利要求1所述保藏编号为cgmcc no.45336的杂交瘤细胞株a7g8分泌产生的。

3.权利要求2所述抗三种赭曲霉毒素广谱性单克隆抗体的应用，其特征在于：制备免疫层析试纸条用于中药复杂基质中赭曲霉毒素的快速检测。

技术总结
本发明公开了一种分泌抗三种赭曲霉毒素广谱性单克隆抗体的杂交瘤细胞株A7G8，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45336。此细胞株分泌的抗三种赭曲霉毒素广谱性单克隆抗体灵敏度高且特异性好，对赭曲霉毒素A、赭曲霉毒素B、赭曲霉毒素C的50％抑制浓度IC50分别为0.37ng/mL、0.23ng/mL和2.24ng/mL，与黄曲霉毒素B1、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、伏马毒素B1的交叉反应率均小于0.037％。基于此抗体开发的免疫层析试纸条检测方法灵敏度高、操作简便、对复杂基质抗干扰性强，适用于中药复杂基质中赭曲霉毒素现场快速大量筛查。

技术研发人员：杨美华,郭梦月,骆骄阳,孔丹丹
受保护的技术使用者：中国医学科学院药用植物研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12