一种猪五体的荧光探针引物、试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及生物学分子，尤其是涉及一种猪五体的荧光探针引物、试剂盒及其应用。

背景技术：

1、猪养殖病害种类繁多，其中五体病感染频发，如不及时监测防治会导致大批猪群感染，造成严重的经济损失。五体是指猪立克次氏体、弓形体、衣原体、钩端螺旋体、支原体。其中前四体对母猪繁殖性能有着严重的影响，都可引起母猪的流产、早产、死胎、弱胎，新生仔猪发病，产后母猪无乳、少乳等，严重影响着母猪的繁殖性能及猪场的生产成绩。

2、立克次氏体病是由立克次氏体(rickettsia)寄生于猪红细胞表面、游离于血浆及骨髓中而引起的以仔猪发热、贫血和黄疸，母猪流产等症状为特征的疾病。

3、衣原体(chlamydia spp.)是一种严格细胞内寄生的、介于细菌和病毒之间的微生物。衣原体呈革兰染色阴性，有核糖体和细胞壁，含有dna和rna两种核酸。衣原体主要与猪的亚临床感染有关，但也可引起呼吸道疾病、腹泻、结膜炎和繁殖障碍。

4、猪肺炎支原体(mhp)，是引起猪支原体肺炎(mps)的主要病原体，该病以接触性、高度传染性、高发病率和低死亡率为特点，主要表现为咳嗽、呼吸困难，其主要危害是引起猪的生长受阻和饲料转化率严重下降，而且容易继发其他病原的感染，诱导形成慢性肺炎。

5、弓形虫(toxoplasma gondii)是引起猪弓形体病的病源寄生虫，是由弓形虫侵入猪体而引起患病的一种原虫病，寄生引起的人畜共患的一种寄生虫病，以高热、呼吸及神经症状、死亡和怀孕母猪流产、畸形胎、死胎为主要特征，部分猪身体下部及耳部有淤血斑。近年来，我县多地发现“无名高热”病猪，后证实主要是由弓形体感染引起的。

6、猪钩端螺旋体病由钩端螺旋体感染所引起，是一种人畜共患的自然疫源性传染病，病初体温上升，采食量下降，尿液呈浓茶样或带有大量血液的红色尿液，渐进性消瘦，受孕的母猪，感染钩端螺旋体后可能会导致母猪发生流产，流出的胎儿为死胎或木乃伊胎。

7、五体感染在猪场是普遍的现象，特别是猪立克次氏体、支原体在猪场的感染率几乎100％，衣原体的感染率也在60％左右，弓形体、螺旋体的带菌率也比较高。因此，猪群长期处于亚健康的状态，一旦气温变化，各种应激反应，猪舍环境不良，猪自身防御功能低下时就开始活动，引发疾病。想要解决母猪五体感染，就需要定期监测五种病原的感染情况，以及环境中的病原含量，及时减少病原含量，提高猪群的免疫力与抗病能力，采取综合性的防控措施，防治结合，才能从根本上解决母猪五体感染的问题。提高母猪繁殖性能，取得良好的生产成绩。

8、然而，目前尚没有能够快速检测五体病的商品化检测试剂盒，因此急需研制符合当前疫情流行趋势，且能够快速高效检测鉴别上述五种病原的荧光定量pcr商品化试剂盒。

技术实现思路

1、本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种猪五体的荧光探针引物、试剂盒及其应用，其中，猪五体包括猪立克次氏体、猪衣原体、猪肺炎支原体、弓形体、猪钩端螺旋体。本技术选择猪立克次氏体orf5基因、猪衣原体glgp基因、猪肺炎支原体p95基因、弓形体b1基因、钩端螺旋体clps基因的保守序列设计探针引物，本发明试剂盒可以同时进行大批量的样本分析，一次检测即可鉴别样本中是否含有猪肺炎支原体、衣原体、立克次氏体、弓形体、钩端螺旋体，具有简便快捷、稳定性好、灵敏度高、特异性强的特点。

2、本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

3、本发明的第一个目的是提供一种用于检测猪立克次氏体orf5基因的引物探针组，所述引物探针组包括：

4、上游引物epe-f:5’-tgggcagagattgctggc-3’；

5、下游引物epe-r：5’-ttttaggggtggggtgga-3’；

6、荧光探针引物epe-p:5’-ccaggcacccctgaaacctggtgcg-3’，其中5’端添加报告基团fam，3’端添加淬灭基团bhq1；

7、orf5基因的引物探针组的目的序列为：

8、tgggcagagattgctggccaggcacccctgaaacctggtgcggaggatt ccaagcctgaagccgtcccttcctccatccaccccacccctaaaa。

9、本发明的第二个目的是提供一种用于检测猪衣原体glgp基因的引物探针组，所述引物探针组包括：

10、上游引物cs-f:5’-caggaatgccgagagttg-3’；

11、下游引物cs-r：5’-cttggaaatggggggtta-3’；

12、荧光探针引物cs-p:5’-ccatagaatcaagaaaacatgctgct-3’，其中5’端添加报告基团hex，3’端添加淬灭基团bhq1；

13、glgp基因的引物探针组的目的序列为：

14、caggaatgccgagagttgccatagaatcaagaaaacatgctgctaatcgacctaaccccccatttccaag。

15、本发明的第三个目的是提供一种用于检测猪肺炎支原体p95基因的引物探针组，所述引物探针组包括：

16、上游引物mps-f:5’-tcaggttgttttttcagagc-3’；

17、下游引物mps-r:5’-taaatttcccccagtcatta-3’；

18、荧光探针引物mps-p:5’-cttcagcagaggtaaaattactatcagc-3’，其中5’端添加报告基团cy5，3’端添加淬灭基团bhq2；

19、p95基因的引物探针组的目的序列为：

20、tcaggttgttttttcagagcttcagcagaggtaaaattactatcagcaag ctctaatttcagtaatgactgggggaaattta。

21、本发明的第四个目的是提供一种用于检测弓形体b1基因的引物探针组，所述引物探针组包括：

22、上游引物tp-f:5’-aacattcttgtgctgcct-3’；

23、下游引物tp-r：5’-tttcacctgtatttgcca-3’；

24、荧光探针引物tp-p:5’-tcctctcatggcaaatgccagaagaagg-3’，其中5’端添加报告基团rox，3’端添加淬灭基团bhq2；

25、b1基因的引物探针组的目的序列为：

26、aacattcttgtgctgcctcctctcatggcaaatgccagaagaagggtac gtgttgcatcataacaagagctgtatttcccgctggcaaatacaggtgaaa。

27、本发明的第五个目的是提供一种用于检测猪钩端螺旋体clps基因的引物探针组，所述引物探针组包括：

28、上游引物lep-f:5’-cacaaactccagacctaaa-3’；

29、下游引物lep-r：5’-agtatgttcgttatcgtcc-3’；

30、荧光探针引物lep-p:5’-atgaaattactgaggagtccacgaaatc-3’，其中5’端添加报告基团cy3，3’端添加淬灭基团bhq2；

31、clps基因的引物探针组的目的序列为：

32、cacaaactccagacctaaatgaaattactgaggagtccacgaaatcaac gggaggaccttggagagttgtactttgggacgataacgaacatact。

33、本发明的第六个目的是提供一种试剂盒，所述试剂盒包括阴性对照、阳性对照、引物预混液、探针预混液、pcr扩增液；

34、所述引物预混液初始浓度为10μm的epe-f、epe-r、cs-f、cs-r、mps-f、mps-r、tp-f、tp-r、lep-f、lep-r摩尔比为1:1:1:1:1:1:1:1:1:1的预混液，

35、epe-f:5’-tgggcagagattgctggc-3’，

36、epe-r：5’-ttttaggggtggggtgga-3’，

37、cs-f:5’-caggaatgccgagagttg-3’，

38、cs-r：5’-cttggaaatggggggtta-3’，

39、mps-f:5’-tcaggttgttttttcagagc-3’，

40、mps-r:5’-taaatttcccccagtcatta-3’，

41、tp-f:5’-aacattcttgtgctgcct-3’，

42、tp-r：5’-tttcacctgtatttgcca-3’，

43、lep-f:5’-cacaaactccagacctaaa-3’，

44、lep-r：5’-agtatgttcgttatcgtcc-3’；

45、所述探针预混液包括初始浓度为10μm的epe-p、cs-p、mps-p、tp-p、lep-p摩尔比为1:1:1:1:1的预混液，

46、epe-p:5’-ccaggcacccctgaaacctggtgcg-3’，其中5’端添加报告基团fam，3’端添加淬灭基团bhq1，

47、cs-p:5’-ccatagaatcaagaaaacatgctgct-3’，其中5’端添加报告基团hex，3’端添加淬灭基团bhq1，

48、mps-p:5’-cttcagcagaggtaaaattactatcagc-3’，其中5’端添加报告基团cy5，3’端添加淬灭基团bhq2，

49、tp-p:5’-tcctctcatggcaaatgccagaagaagg-3’，其中5’端添加报告基团rox，3’端添加淬灭基团bhq2，

50、lep-p:5’-atgaaattactgaggagtccacgaaatc-3’，其中5’端添加报告基团cy3，3’端添加淬灭基团bhq2；

51、所述阳性对照为含有orf5基因、glgp基因、p95基因、b1基因和clps目的基因片段的重组质粒；

52、所述阴性对照为双蒸水；

53、所述pcr扩增液为南京诺唯赞生物科技股份有限公司生产的2×animaldetection probe master mix。

54、本发明的第七个目的是提供一种上述试剂盒的应用，所述应用具体包括以下步骤：

55、(1)提取待测样品的总dna备用；

56、(2)以步骤(1)中得到的总dna为模板，利用试剂盒配置荧光反应体系进行荧光扩增作为实验组；以阴性对照为模板，利用试剂盒配置荧光反应体系进行荧光扩增作为阴性对照组；以阳性对照为模板，利用试剂盒配置荧光反应体系进行荧光扩增作为阳性对照组；

57、(3)根据步骤(2)的荧光扩增反应结果判定待测样品为猪立克次氏体、猪衣原体、猪肺炎支原体、弓形体和/或猪钩端螺旋体核酸阳性或阴性。

58、在本发明的一个实施方式中，步骤(2)中，以荧光反应体系总体积为25μl计，实验组包括样品总dna 5μl，引物预混液6μl(400nm)，探针预混液1.5μl(100nm)，pcr扩增液12.5μl；

59、阴性对照组包括引物预混液6μl，探针预混液1.5μl，pcr扩增液12.5μl，rnasefree h2o 5μl；

60、阳性对照组包括含有orf5基因、glgp基因、p95基因、b1基因和clps目的基因片段的重组质粒5μl，引物预混液6μl，探针预混液1.5μl，pcr扩增液12.5μl。

61、在本发明的一个实施方式中，所述引物预混液包括初始浓度为10μm的epe-f、epe-r、cs-f、cs-r、mps-f、mps-r、tp-f、tp-r、lep-f、lep-r摩尔比为1:1:1:1:1:1:1:1:1:1的预混液；

62、所述探针预混液包括初始浓度为10μm的epe-p、cs-p、mps-p、tp-p、lep-p摩尔比为1:1:1:1:1的预混液。

63、在本发明的一个实施方式中，步骤(2)中，所述荧光扩增的反应程序具体为：37℃2min，95℃30s，循环为95℃10s，58℃30s(采集荧光信号)，共计45个循环，共5个荧光通道，分别是报告基团“fam”，淬灭基团“bhq1”，报告基团“hex”，淬灭基团“bhq1”，报告基团“cy5”，淬灭基团“bhq2”，报告基团“rox”，淬灭基团“bhq2”，报告基团“cy3”，淬灭基团“bhq2”。

64、在本发明的一个实施方式中，步骤(3)中，结果判定：阳性对照五个通道ct值＜30并出现特异的s型扩增曲线，阴性对照无ct值且无特异的扩增曲线，二者均成立可判定实验结果成立；

65、(1)被检样品fam通道ct值≤35并出现特异的s型扩增曲线，判为猪立克次氏体核酸阳性；无ct值且无特异的扩增曲线，判为猪立克次氏体核酸阴性；35＜ct值＜45并出现特异的扩增曲线，判为猪立克次氏体核酸可疑，可疑样品需重新取样提取dna，进行复检，ct值＜45判为阳性，否则判为阴性；

66、(2)被检样品hex通道ct值≤35并出现特异的s型扩增曲线，判为猪衣原体核酸阳性；无ct值且无特异的扩增曲线，判为猪衣原体核酸阴性；35＜ct值＜45并出现特异的扩增曲线，判为猪衣原体核酸可疑，可疑样品需重新取样提取dna，进行复检，ct值＜45判为阳性，否则判为阴性；

67、(3)被检样品cy5通道ct值≤35并出现特异的s型扩增曲线，判为猪肺炎支原体核酸阳性；无ct值且无特异的扩增曲线，判为猪肺炎支原体核酸阴性；35＜ct值＜45并出现特异的扩增曲线，判为猪肺炎支原体核酸可疑，可疑样品需重新取样提取dna，进行复检，ct值＜45判为阳性，否则判为阴性；

68、(4)被检样品rox通道ct值≤35并出现特异的s型扩增曲线，判为弓形体核酸阳性；无ct值且无特异的扩增曲线，判为弓形体核酸阴性；35＜ct值＜45并出现特异的扩增曲线，判为弓形体核酸可疑，可疑样品需重新取样提取dna，进行复检，ct值＜45判为阳性，否则判为阴性；

69、(5)被检样品cy3通道ct值≤35并出现特异的s型扩增曲线，判为猪钩端螺旋体核酸阳性；无ct值且无特异的扩增曲线，判为猪钩端螺旋体核酸阴性；35＜ct值＜45并出现特异的扩增曲线，判为猪钩端螺旋体核酸可疑，可疑样品需重新取样提取dna，进行复检，ct值＜45判为阳性，否则判为阴性。

70、本发明中，ct值为从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数。

71、在本发明的一个实施方式中，阳性对照为浓度为104copise/μl的阳性标准品。

72、在本发明的一个实施方式中，上述试剂盒还应用于环境样本检测。

73、与现有技术相比，本发明优点如下：

74、1)猪立克次氏体、猪衣原体、猪肺炎支原体、弓形体、猪钩端螺旋体的基因组在100000-2000000bp，基因组庞大且相关的研究较少，通过毒力蛋白基因的同源性比对，选择保守的基因序列进行探针引物的设计，根据基因序列分析，本发明分别选取epe orf5基因、cs glgp基因、mps p95基因、tp b1基因和lep clps基因的保守区域设计荧光探针引物组。

75、2)五重荧光定量实验是在一个反应管中同时扩增5个靶标基因进行定量实验，因此5个靶标基因的扩增势必会互相影响，所以要通过引物设计以及反应条件的优化来同步扩增效率，而不是在同一反应管中将所有引物和模板简单的混合。由于epe、cs、mps、tp、lep是五种不同的病原，根据具体感染情况，共感染的样本中五种病原浓度可能存在不同程度的差异，在同一反应管中扩增时，如果出现一种病原基因扩增效率过高，那么其他病原基因的扩增可能受到抑制，最终影响病原的检出率；本发明通过引物和探针的设计，在五种病原的高度保守的序列中各设计五对探针引物，通过实验匹配灵敏度较高且扩增效率接近的探针引物进行多重荧光定量pcr实验，过程较困难且结果不易控制，需要进行多次实验；同时通过调整引物与荧光探针的比例，优化反应条件，使样本中五种病原基因的扩增效率一致，并且与每个单重反应的灵敏度一致。

76、3)本发明的特异性较强，对于猪瘟病毒，猪圆环病毒，猪伪狂犬病毒，猪蓝耳病毒，猪细小病毒和猪乙型脑炎病毒，均无非特异性扩增曲线，保证检测的准确性。

77、4)本发明可以同时进行大批量的样本分析，在一次检测操作后，即可鉴别样本中是否含有猪立克次氏体、猪衣原体、猪肺炎支原体、弓形体、猪钩端螺旋体，这五种国内流行的导致猪群亚健康的病原，具有灵敏性高、特异性强、重复性好的特点。