一种炭疽菌原生质体的制备方法及遗传转化体系的构建方法

1.本发明属于微生物遗传转化技术领域，具体涉及一种炭疽菌原生质体的制备方法及遗传转化体系的构建方法。


背景技术：

2.山茶炭疽菌为炭疽菌属(colletotrichum)真菌，是茶树炭疽病的主要优势病原种之一，对茶树具有较高的致病性和危害。为了降低山茶炭疽菌对茶树的危害，防控茶树炭疽病，采用基因工程手段对山茶炭疽菌致病相关基因进行研究尤为重要，然而，目前对于山茶炭疽菌致病相关基因的功能分析鲜见报道，原因在于缺少稳定的山茶炭疽菌遗传转化体系，无法满足山茶炭疽菌致病相关基因功能分析的基本要求，进而迫切需要建立高效稳定的peg介导的山茶炭疽菌遗传转化体系，为后续研究山茶炭疽菌的关键致病基因提供技术依据。
3.尽管，现有技术中也存在山茶炭疽菌遗传转化体系的相关研究，但是其多采用裂解酶对山茶炭疽菌的原生质体进行提取所获得的原生质体数量少，质量差，且步骤繁琐，导致山茶炭疽菌的遗传转化效率不高。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种炭疽菌原生质体的制备方法及遗传转化体系的构建方法，所述炭疽菌原生质体的制备方法制备得到的原生质体数量多，质量好且步骤简便，进而可以提高后续遗传转化体系的转化效率。
5.本发明提供了一种炭疽菌原生质体的制备方法，包括如下步骤：
6.将炭疽菌菌丝与酶解液混合，裂解，得到裂解液；
7.将所述裂解液培养3～8h，得到原生质体液，所述原生质体液中包括炭疽菌原生质体；
8.所述酶解液包括溶剂和溶质，所述溶剂包括磷酸缓冲液，所述溶质包括崩溃酶1～3wt.％和溶壁酶0.5～1wt.％。
9.优选的，所述炭疽菌原生质体在所述原生质体液中的浓度为(1.6～3.6)
×
107个/ml。
10.优选的，所述裂解的震荡频率为80～120rpm，温度为28～32℃，时间为10～30min。
11.优选的，所述炭疽菌包括山茶炭疽菌。
12.优选的，所述炭疽菌菌丝的制备方法包括：
13.将活化的炭疽菌菌株接种至孢子培养基中进行孢子培养，得到分生孢子；
14.将所述分生孢子接种至菌丝培养基中进行菌丝培养，得到炭疽菌菌丝；所述菌丝培养的震荡频率为150～200rpm，温度为25～28℃，时间为12～16h。
15.本发明还提供了上述技术方案所述的制备方法在构建炭疽菌遗传转化体系中的应用。
16.本发明还提供了一种炭疽菌遗传转化体系的构建方法，包括如下步骤：
17.采用上述技术方案所述的制备方法制备得到炭疽菌原生质体；
18.将所述炭疽菌原生质体与stc溶液混合，得到炭疽菌原生质体悬浮液；
19.将所述炭疽菌原生质体悬浮液、含有抗生素标记基因和目的基因的质粒、肝素钠溶液混合，0～4℃静置30min，得到第一原生质体溶液；
20.向所述第一原生质体溶液中逐滴加入sptc溶液，0～4℃静置30min，得到第二原生质体溶液；
21.将所述第二原生质体溶液悬浮于再生培养基复苏，得到复苏的原生质体溶液；
22.将所述复苏的原生质体溶液与选择性培养基混合，暗培养3～5d，得到炭疽菌遗传转化体系。
23.优选的，所述炭疽菌原生质体悬浮液的体积、含有抗生素标记基因和目的基因的质粒的质量和肝素钠溶液的体积的比值为0～100μl：1～5μg：1～2μl；所述炭疽菌原生质体悬浮液中山茶炭疽菌原生质体的浓度为(1～3)
×
105个/μl；所述肝素钠溶液的浓度为0.1g/ml。
24.优选的，所述再生培养基以水为溶剂，包括：酵母粉1wt.％，酪蛋氨基酸1wt.％和蔗糖274wt.％；ph值为7.0；
25.所述选择性培养基以水为溶剂，包括：马铃薯汁20wt.％，葡萄糖2wt.％，琼脂1.5wt.％和与所述抗生素标记基因对应的抗生素。
26.优选的，所述抗生素标记基因包括g418抗性表达基因。
27.有益效果：
28.本发明提供了一种炭疽菌原生质体的制备方法，包括如下步骤：将炭疽菌菌丝与酶解液混合，震荡裂解，得到裂解液；将所述裂解液进行震荡培养3～8h，得到原生质体液，所述原生质体液中包括炭疽菌原生质体；所述酶解液以磷酸缓冲液为溶剂，包括崩溃酶1～3wt.％和溶壁酶0.5～1wt.％。本发明以磷酸缓冲液溶解崩溃酶和溶壁酶制备成的酶解液对炭疽菌菌丝进行裂解制备炭疽菌原生质体，获得的原生质体数量多，质量好，且步骤简便易操作。以此方法获得的炭疽菌原生质体可以快速有效获得peg介导的炭疽菌遗传转化体系，且转化效率较高。
附图说明
29.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
30.图1为实施例1～6和对比例1中制备得到的裂解液中的炭疽菌原生质体数量统计图；
31.图2为实施例1～6和对比例1中制备得到的裂解液中的炭疽菌原生质体形态图；
32.图3为实施例7中的g418抗性筛选结果；
33.图4为测试例2中转化子基因组提取的琼脂糖凝胶电泳检测图；
34.图5为测试例2中转化子中目的基因pcr扩增的琼脂糖凝胶电泳检测图；
35.图6为测试例2中荧光显微镜下观察转化子中的gfp荧光图；
36.图7为实施例8中山茶炭疽菌遗传转化体系的构建方法的流程图。
具体实施方式
37.本发明提供了一种炭疽菌原生质体的制备方法，包括如下步骤：
38.将炭疽菌菌丝与酶解液混合，裂解，得到裂解液；
39.将所述裂解液培养3～8h，得到原生质体液，所述原生质体液中包括炭疽菌原生质体；
40.所述酶解液包括溶剂和溶质，所述溶剂包括磷酸缓冲液，所述溶质包括崩溃酶1～3wt.％和溶壁酶0.5～1wt.％。
41.在本发明中，所述炭疽菌优选包括植物炭疽菌，进一步优选包括山茶炭疽菌。本发明对所述山茶炭疽菌的菌株没有特殊限定，本领域中常规山茶炭疽菌菌株均可以采用本发明中的制备方法制备原生质体，如本发明实施例中采用的是山茶炭疽菌ls_19菌株。
42.本发明优选制备炭疽菌菌丝，所述炭疽菌菌丝的制备方法优选包括：
43.将活化的炭疽菌菌株接种至孢子培养基中进行孢子培养，得到分生孢子；
44.将所述分生孢子接种至菌丝培养基中进行菌丝培养，得到炭疽菌菌丝；所述菌丝培养的震荡频率为150～200rpm，温度为25～28℃，时间为12～16h。
45.本发明优选将活化的炭疽菌菌株接种至孢子培养基中进行孢子培养，得到孢子培养液。本发明所述炭疽菌菌株的接种量与孢子培养基的体积比优选为(1～5)：(10～50)，更优选为1：50。本发明对所述炭疽菌菌株的活化方法没有特殊限定，采用本领域中常规活化方法即可。本发明所述孢子培养基优选包括pdb液体培养基。本发明所述孢子培养优选为恒温震荡培养，所述孢子培养优选于摇床上进行。本发明所述孢子培养的震荡频率优选为150～200rpm，更优选为200rpm；温度优选为25～28℃，更优选为28℃；时间优选为60～72h，更优选为72h。本发明所述孢子培养优选为黑暗培养。
46.得到所述孢子培养液后，本发明优选还包括将所述孢子培养液进行过滤，将得到的培养液进行第一离心，弃上清，得到分生孢子。本发明优选采用覆盖有过滤膜的灭菌漏斗进行所述过滤。所述过滤膜优选包括三层miracloth过滤膜，所述miracloth过滤膜的孔径优选为22～25mm，更优选为22mm；所述miracloth过滤膜的材质优选为聚酯人造纤维滤布。本发明进行所述过滤前优选还包括对所述过滤膜进行高压灭菌和烘干，所述高压灭菌的温度优选为121℃，时间为20min。本发明所述第一离心的温度优选为0～4℃，更优选为4℃，转速优选为3000～5000rpm，更优选为5000rpm，时间优选为3～10min，更优选为5min。
47.得到所述分生孢子后，本发明优选将所述分生孢子接种至菌丝培养基中进行菌丝培养，得到炭疽菌菌丝培养液。本发明所述菌丝培养基优选包括m3s液体培养基。本发明所述菌丝培养的震荡频率优选为150～200rpm，更优选为200rpm；温度优选为25～28℃，更优选为28℃；时间优选为12～16h，更优选为14h。本发明所述12～16h的震荡培养可以使炭疽菌菌丝保持适宜的成熟度，避免因菌丝过于成熟而降低裂解得到的原生质体的数量和质量。本发明所述菌丝培养优选为恒温培养。
48.得到所述炭疽菌菌丝培养液后，本发明优选将所述炭疽菌菌丝培养液进行过滤。本发明进行所述过滤使用的过滤装置优选与上述进行孢子培养液过滤时使用的过滤装置相同，不再赘述。
49.所述过滤后，本发明优选使用无菌水对过滤得到的菌丝进行冲洗，得到炭疽菌菌丝。本发明所述冲洗的次数优选为3次。
50.得到所述炭疽菌菌丝后，本发明将所述炭疽菌菌丝与酶解液混合，裂解，得到裂解液。本发明所述炭疽菌菌丝与酶解液的质量体积比优选为0.1～1g：5～20ml，更优选为0.1～1g：10ml。本发明所述酶解液优选包括溶剂和溶质，所述溶剂优选包括磷酸缓冲液，所述溶质优选包括崩溃酶1～3wt.％和溶壁酶0.5～1wt.％，更优选包括崩溃酶2wt.％和溶壁酶1wt.％。与常规裂解酶相比，本发明所述酶解液裂解效果更好，裂解获得的原生质数量更多，质量更好。本发明所述裂解的震荡频率优选为80～120rpm，更优选为100rpm；温度优选为28～32℃，更优选为30.5℃；时间优选为10～30min，更优选为20min。本发明所述裂解优选于摇床上进行。
51.得到所述裂解液后，本发明优选还包括对所述裂解液进行过滤。本发明优选采用细菌过滤器进行所述过滤，所述细菌过滤器的孔径优选为0.22μm。
52.所述过滤后，本发明优选将得到的裂解液培养2～8h，得到原生质体液。本发明所述培养的震荡频率优选为80～120rpm，更优选为100rpm；温度优选为28～30℃，更优选为30.5℃。本发明所述培养的时间优选为5～8h，进一步优选为6～7h，更优选为7h。本发明所述原生质体液中包括炭疽菌原生质体，所述炭疽菌原生质体在所述原生质体液中的浓度优选为(1.6～3.6)
×
107个/ml，更优选为3.6
×
107个/ml。本发明在所述培养2h后，优选还包括每1小时对所述培养的原生质体液观察一次，直至达到上述浓度。本发明所述培养优选在摇床上进行。
53.得到所述原生质体溶液后，本发明优选对所述原生质体液进行第二离心，弃上清，得到炭疽菌原生质体。本发明所述第二离心的温度优选为0～4℃，更优选为4℃，转速优选为2000～4000rpm，更优选为3000rpm，时间优选为3～10min，更优选为5min。
54.本发明以磷酸缓冲液溶解崩溃酶和溶壁酶制备成酶解液对炭疽菌菌丝进行裂解制备炭疽菌原生质体，获得的原生质体数量多，质量好，且步骤简便易操作。
55.基于上述优势，本发明还提供了上述技术方案所述的制备方法在构建炭疽菌遗传转化体系中的应用。本发明所述炭疽菌优选包括植物炭疽菌，更优选包括山茶炭疽菌。
56.本发明还提供了一种炭疽菌遗传转化体系的构建方法，包括如下步骤：
57.采用上述技术方案所述的制备方法制备得到炭疽菌原生质体；
58.将所述炭疽菌原生质体与stc溶液混合，得到炭疽菌原生质体悬浮液；
59.将所述炭疽菌原生质体悬浮液、含有抗生素标记基因和目的基因的质粒、肝素钠溶液混合，0～4℃静置30min，得到第一原生质体溶液；
60.向所述第一原生质体溶液中加入sptc溶液，0～4℃静置30min，得到第二原生质体溶液；
61.将所述第二原生质体溶液悬浮于再生培养基中复苏，得到复苏的原生质体溶液；
62.将所述复苏的原生质体溶液与选择性培养基混合，暗培养3～5d，得到炭疽菌遗传转化体系。
63.在本发明中，所述炭疽菌遗传转化体系优选包括炭疽菌遗传转化体系。
64.本发明采用上述技术方案所述的制备方法制备炭疽菌原生质体。本发明制备所述炭疽菌原生质体的步骤和过程优选与上述技术方案相同，不再进行赘述。
65.得到所述炭疽菌原生质体后，本发明将所述炭疽菌原生质体与stc溶液混合，得到炭疽菌原生质体悬浮液。本发明所述混合过程优选包括：将炭疽菌原生质体与stc溶液混合
和第三离心，重复此过程两次。本发明所述第三离心的条件优选与所述第二离心的条件相同，不再赘述。本发明所述炭疽菌原生质体悬浮液中炭疽菌原生质体的浓度优选为(1～3)
×
105个/μl。
66.得到所述炭疽菌原生质体悬浮液后，本发明将所述炭疽菌原生质体悬浮液、含有抗生素标记基因和目的基因的质粒、肝素钠溶液混合，0～4℃静置30min，得到第一原生质体溶液。本发明所述炭疽菌原生质体悬浮液的体积、含有抗生素标记基因和目的基因的质粒的质量和肝素钠溶液的体积的比值为优选为20～100μl：1～5μg：1～2μl，更优选为50μl：2μg：1μl。本发明所述肝素钠溶液的浓度优选为0.1g/ml。本发明所述含有抗生素标记基因和目的基因的质粒中的抗性标记基因优选包括g418抗性表达基因或潮霉素b抗性表达基因，更优选为g418抗性表达基因。本发明所述含有抗生素标记基因和目的基因的质粒中初始质粒优选包括pbluescriptⅱ(+)、pbargpe1-hygro(+)或pbin(+)质粒，更优选为pbluescriptⅱ(+)质粒。本发明对所述含有抗生素标记基因和目的基因的质粒中的目的基因没有特殊限定，任意炭疽菌相关基因或模式标记基因均可，如本发明实施例中采用的是绿色荧光蛋白gfp基因。
67.得到所述第一原生质体溶液后，本发明向所述第一原生质体溶液中加入sptc溶液，0～4℃静置30min，得到第二原生质体溶液。本发明所述sptc溶液与所述炭疽菌原生质体悬浮液的体积比优选为2：1。本发明所述加入优选为逐滴加入，采用逐滴加入的方式将所述sptc溶液加入所述第一原生质体溶液中的方式通过引起细胞膜表面电荷的紊乱，干扰细胞间的识别，从而有利于细胞间融合和外源dna分子进入原生质体。
68.得到所述第二原生质体溶液后，本发明将所述第二原生质体溶液悬浮于再生培养基中复苏，得到复苏的原生质体溶液。本发明所述第二原生质体溶液与所述再生培养基的体积比优选为1：20。本发明所述再生培养基优选以水为溶剂，还包括：酵母粉1wt.％，酪蛋氨基酸1wt.％和蔗糖274wt.％；所述再生培养基的ph值优选为7.0。本发明优选于恒温震荡培养箱中进行所述复苏，所述复苏的温度优选为25～28℃，更优选为26℃；震荡频率优选为80～120rpm，更优选为100rpm；时间优选为12～16h，更优选为16h。
69.得到所述复苏的原生质体溶液后，本发明将所述复苏的原生质体溶液与选择性培养基混合，暗培养3～5d，得到炭疽菌遗传转化体系。本发明所述复苏的原生质体溶液与选择培养基的体积比优选为1～3：10～30，更优选为1：20。本发明进行所述暗培养前，优选还包括将所述复苏的原生质体溶液与选择性培养基的混合物倒入培养皿中。本发明所述暗培养优选在恒温培养箱中进行。本发明所述暗培养的时间优选为5d；温度优选为25～28℃，更优选为28℃。本发明所述选择性培养基优选以水为溶剂，包括：马铃薯汁20wt.％，葡萄糖2wt.％，琼脂1.5wt.％和与所述抗生素标记基因对应的抗生素；所述选择性培养基的ph值优选为自然值。本发明所述抗生素的浓度优选依据所述抗生素标记基因进行设定；在本发明的实施例中，选择培养基中包括g418(遗传霉素)，且所述g418的浓度优选为150μg/ml。
70.为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
71.下述实施例中使用的试剂、培养基及配制方法：
72.pda固体培养基：以水为溶剂，马铃薯汁20wt.％，葡萄糖2wt.％，琼脂2wt.％，ph值为自然值，121℃高压灭菌20min；
73.pdb液体培养基：以水为溶剂，马铃薯汁20wt.％，葡萄糖2wt.％，ph值为自然值，121℃高压灭菌20min；
74.m3s液体培养基：以水为溶剂，七水合硫酸镁2.5wt.％，磷酸二氢钾2.7wt.％，蛋白胨1wt.％，酵母膏1wt.％，蔗糖10wt.％，ph自然值，121℃高压灭菌20min；
75.再生培养基：以水为溶剂，酵母粉1wt.％，酪蛋氨基酸1wt.％，蔗糖274wt.％，ph值为7.0，121℃高压灭菌20min；
76.菌株选择性培养基：以水为溶剂，马铃薯汁20wt.％，葡萄糖2wt.％，琼脂1.5wt.％，ph自然值，121℃高压灭菌20min，按照所要获得培养基中的g418浓度，加入相对应浓度的g418；
77.lb液体培养基：以水为溶剂，酵母粉5wt.％，氯化钠10wt.％，胰蛋白胨10wt.％，ph＝7.0，121℃高压灭菌20min；
78.肝素钠溶液：100mg肝素钠粉末溶于1ml无菌蒸馏水中，0.22μm细菌过滤器进行过滤除菌；
79.g418：购买于北京酷来搏科技有限公司；
80.酶解液：崩溃酶2wt.％，溶壁酶1wt.％，10ml磷酸缓冲液，0.22μm细菌过滤器进行过滤除菌，其中磷酸缓冲液为：以水为溶剂，氯化钠7wt.％，氯化钙1wt.％，磷酸氢二钠0.5wt.％，ph自然值，使用双蒸水定容到1l，121℃灭菌20min；
81.stc试剂：sorbitol 145.6g，tris 6.05g，cacl2·
h2o 7.35g，溶于1l无菌蒸馏水，ph值为7，121℃高压灭菌20min；
82.sptc试剂：40g peg溶于100ml stc试剂，121℃高压灭菌20min。
83.实施例1
84.一种山茶炭疽菌原生质体的制备方法，步骤如下：
85.a1)将新鲜的活化的山茶炭疽菌ls_19接种到pdb液体培养基中，28℃恒温摇床200rpm，黑暗培养72h，产生大量分生孢子；
86.a2)在灭菌漏斗上覆盖三层miracloth过滤膜，过滤上述培养液，4℃5000rpm离心5min，弃上清，收集分生孢子；
87.a3)将分生孢子置于50mlm3s液体培养基中，28℃恒温摇床200rpm，黑暗培养14h，培养产生幼嫩的菌丝；
88.a4)在灭菌漏斗上覆盖三层miracloth过滤膜，过滤上述溶液，收集滤膜上的幼嫩菌丝，然后用无菌水冲洗三次，将收集的1g幼嫩菌丝加入到无菌三角锥瓶中；
89.a5)配制10ml酶解液(10ml磷酸缓冲液中含有崩溃酶2wt.％和溶壁酶1wt.％)，30.5℃恒温摇床100rpm，摇培10～30min，0.22μm细菌过滤器进行过滤除菌后加入至三角锥瓶中；
90.a6)将上述溶液放置于恒温振荡培养箱中，温度为30.5℃，转速为100rpm，培养7h，两个小时后，每隔1小时观察一次，获得原生质体液；
91.a7)将步骤a6)中获得的原生质体液置于离心机里，4℃3000rpm离心5min，弃上清备用。
92.实施例2
93.采用实施例1中的制备方法制备山茶炭疽菌原生质体，区别在于，步骤a6)中的培
养时间为8h。
94.实施例3
95.采用实施例1中的制备方法制备山茶炭疽菌原生质体，区别在于，步骤a6)中的培养时间为6h。
96.实施例4
97.采用实施例1中的制备方法制备山茶炭疽菌原生质体，区别在于，步骤a6)中的培养时间为5h。
98.实施例5
99.采用实施例1中的制备方法制备山茶炭疽菌原生质体，区别在于，步骤a6)中的培养时间为4h。
100.实施例6
101.采用实施例1中的制备方法制备山茶炭疽菌原生质体，区别在于，步骤a6)中的培养时间为3h。
102.对比例1
103.采用实施例1中的制备方法制备山茶炭疽菌原生质体，区别在于，步骤a6)中的培养时间为2h。
104.测试例1
105.分别吸取适量实施例1～6和对比例1中步骤6)中制备得到的原生质体液，置于血球计数板上，在普通光学显微镜下观察原生质体数量和质量，结果如图1～2所示，其中在图2中左图和右图分别为为对比例1(2h)和实施例1(7h)中制备得到的炭疽菌原生质体的形态图；图2的标尺为100μm。
106.由图1可以得出：采用实施例1～6和对比例1的制备方法制备得到的裂解溶液中的原生质体的数量分别为3.6
×
107、3.1
×
107、3.0
×
107、2.6
×
107、2.2
×
107、1.6
×
107和0.4
×
107个/ml；结合图2可以看出2h时可观察到具有一定数量的原生质体，但原生质体体积较小，随着裂解时间的增加，原生质体的数量不断增多，7h时，原生质体的数量最多，且原生质体圆润饱满。
107.对比例2
108.采用实施例1中的制备方法制备山茶炭疽菌原生质体，区别在于，步骤a5)中的酶解液组分为10ml生理盐水中含有崩溃酶2wt.％和溶壁酶1wt.％，步骤a6)裂解的时间为2～8h。
109.将步骤a6)中制备得到的原生质体液，置于血球计数板上，在普通光学显微镜下观察原生质体数量和质量，结果发现对比例2中得到的原生质体破碎多，质量不高，裂解2～8h后获得的原生质体数量在(1～20)
×
105个/ml之间。
110.对比例3
111.采用实施例1中的制备方法制备山茶炭疽菌原生质体，区别在于，步骤a5)中的酶解液组分为10ml磷酸缓冲液中含有蜗牛酶2wt.％和溶菌酶1wt.％，步骤a6)裂解的时间为2～8h。
112.将步骤a6)中制备得到的原生质体液，置于血球计数板上，在普通光学显微镜下观察原生质体数量和质量，结果发现对比例3中得到的原生质体数量少，裂解2～8h数量在(1
～5)
×
105个/ml之间。
113.对比例4
114.采用实施例1中的制备方法制备山茶炭疽菌原生质体，区别在于，步骤a5)中的酶解液组分为10ml磷酸缓冲液中含有溶壁酶2wt.％和崩溃酶1wt.％，步骤a6)裂解的时间为2～8h。
115.将步骤a6)中制备得到的原生质体液，置于血球计数板上，在普通光学显微镜下观察原生质体数量和质量，结果发现对比例4中得到的原生质体数量少，裂解2～8h数量在(1～10)
×
105个/ml之间。
116.对比例5
117.采用实施例1中的制备方法制备山茶炭疽菌原生质体，区别在于，步骤a5)中的酶解液组分为10ml磷酸缓冲液中含有蜗牛酶2wt.％和崩溃酶1wt.％，步骤a6)裂解的时间为2～8h。
118.将步骤a6)中制备得到的原生质体液，置于血球计数板上，在普通光学显微镜下观察原生质体数量和质量，结果发现对比例5中得到的原生质体数量少，裂解2～8h数量在(1～10)
×
105个/ml之间。
119.对比例6
120.采用实施例1中的制备方法制备山茶炭疽菌原生质体，区别在于，步骤a5)中的酶解液组分为10ml磷酸缓冲液中含有蜗牛酶2wt.％，纤维素酶2wt.％和溶菌酶1wt.％，步骤a6)裂解的时间为2～8h。
121.将步骤a6)中制备得到的原生质体液，置于血球计数板上，在普通光学显微镜下观察原生质体数量和质量，结果发现对比例6中裂解2～8h基本没有原生质体。
122.实施例7
123.g418抗性筛选
124.山茶炭疽菌ls_19在恒温培养箱28℃黑暗培养3-5天，取5mm菌饼分别接种于含有浓度为0(ck)、50、100和150μg/ml，g418的pda固体培养基上，置于恒温培养箱中静置培养4天，统计菌落直径并拍照记录，每个处理设置3个重复，并将该实验重复三次，结果如图3所示。
125.由图3可以看出，在150μg/ml浓度g418的pda固体培培养基几乎不生长，而在含有浓度为0(ck)、50和100mg/ml的pda固体培养基上均有山茶炭疽菌ls_19菌落生长，进而得到山茶炭疽菌ls_19菌株对g418的最低抑菌浓度为150μg/ml。
126.实施例8
127.一种山茶炭疽菌遗传转化体系的构建方法，其构建流程图如图7所示，步骤如下：
128.1、质粒dna的制备，步骤如下：
129.所用质粒pbluescriptⅱ(+)-g418-gfp由pbluescriptⅱ(+)质粒与g418抗性表达基因(在ncbi数据库中的登录号为aag34543.1)以及绿色荧光蛋白gfp(在ncbi数据库中的登录号为ana76508.1)基因融合而成，具体步骤如下：
130.采用同源重组的策略，将pcr克隆的g418抗性表达基因与单酶切xbaⅰ线性化载体pbluescriptⅱ(+)进行重组反应，得到重组产物；按照大肠杆菌dh5α(购买于北京擎科生物科技有限公司)方法转入重组产物至dh5α感受态细胞，接入lb固体培养基(含100mg/ml氨苄
青霉素)，过夜培养12-16h，挑取单克隆大肠杆菌菌落置于lb液体培养基过夜培养12-16h，用质粒提取试剂盒(购买于北京擎科生物科技有限公司)的方法提取质粒pbluescriptⅱ(+)-g418备用；进一步克隆绿色荧光蛋白基因gfp片段与单酶切kpnⅰ线性化载体pbluescriptⅱ(+)-g418进行重组反应，得到重组产物；按照大肠杆菌dh5α(购买于北京擎科生物科技有限公司)方法转入重组产物至dh5α感受态细胞，接入lb固体培养基(含100mg/ml氨苄青霉素)，过夜培养12-16h，挑取单克隆大肠杆菌菌落置于lb液体培养基过夜培养12-16h，用质粒提取试剂盒(购买于北京擎科生物科技有限公司)的方法提取质粒pbluescriptⅱ(+)-g418-gfp备用。
131.2、b1)将实施例1制备得到的山茶炭疽菌原生质体，用1ml stc溶液冲洗沉淀两次，每次都置于离心机内，4℃3000rpm离心5min，得到stc溶液悬浮的原生质体溶液；
132.b2)向500μl步骤b1)中得到的stc溶液悬浮的原生质体溶液中加入20μg步骤1中制备得到的质粒pbluescriptⅱ(+)-g418-gfp和10μl肝素钠溶液，轻柔充分混匀，0～4℃静置30min；
133.b3)逐滴加入1ml sptc溶液，轻柔充分混匀，0～4℃静置30min；
134.b4)将获得的原生质体溶液悬浮于20ml再生培养基中，然后放置于恒温震荡培养箱中，26℃，转速为100rpm，培养16h；
135.b5)将复苏后的原生质体与选择性培养基混合，倒成平板，放入恒温培养箱中静置黑暗培养3-5d，观察转化子生长情况。
136.测试例2
137.在g418(150μg/ml)选择性培养基上筛选转化子，生长3-5d后，首先通过pcr方法检测g418的插入情况，再通过荧光显微镜观察转化子是否有gfp荧光。
138.1、转化子的pcr鉴定
139.1.1基因组的提取：
140.(1)从选择性培养基平板上，切下菌丝块，置于1.5ml离心管中，加入500μldeb，组织破碎仪进行研磨；
141.(2)4℃，12000rpm离心10min，取500μl上清置于新的1.5ml离心管中；
142.(3)向离心管中加入等体积异丙醇，颠倒混匀；
143.(4)4℃，12000rpm离心5min，弃上清；
144.(5)向离心管中加入700μl 70％乙醇，颠倒混匀，洗去杂质；
145.(6)4℃，12000rpm离心5min，弃上清；
146.(7)待乙醇挥发后，向离心管中加入50μl无菌蒸馏水，溶解沉淀；
147.(8)4℃，12000rpm离心5min，取上清于新的1.5ml离心管中，置于-20℃保存备用。
148.1％琼脂糖凝胶电泳检测基因组质量，用紫外凝胶成像系统拍照并保存图片，如图4所示，其中marker：5000bp，1，2，3：实施例8中获得的转化子，4：山茶炭疽菌ls_19；
149.由图4可以得出：在图中1234都有条带，且总长度均大于5000bp，未见明显拖尾现象，可见基因组质量良好，提取方法可行，可以用作模板进行pcr扩增。
150.1.2目的基因pcr扩增
151.分别以转化子菌株和ls_19的总基因组dna，pbluescriptⅱ(+)-g418-gfp为模板对照，g418保守序列设计引物进行pcr扩增，扩增片段约400bp
152.g418-f：5
’‑
ctctgatgccgccgtgtt-3’(seq id no.1)
153.g418-r：5
’‑
ccctgatgctcttcgtcca-3’(seq id no.2)；
154.pcr扩增体系和程序分别如表1和表2所示：
155.表1 pcr扩增体系
156.模板1μl2
×
mix12.5μl引物(g418-f)0.5μl引物(g418-r)0.5μlddh2o补至25μl
157.表2 pcr扩增程序
[0158][0159]
1％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，并使用紫外凝胶成像系统观察并拍照保存，结果如图5所示，其中m：2000bp maker；1，2：突变体转化子；3：pbluescriptⅱ(+)-g418-gfp；4：山茶炭疽菌ls_19。
[0160]
由图5可以看出：转化子和pbluescriptⅱ(+)-g418-gfp条带大小在400bp左右，山茶炭疽菌ls_19无条带，可见g418片段成功插入其基因组。
[0161]
2、荧光显微镜观察转化子的gfp荧光，无菌条件下，挑取不同部位的菌丝置于载玻片上，放置于荧光显微镜下观察并拍照保存，结果如图6所示，是菌丝样品局部显微成像，其中左图为明场，右图为绿色荧光场，标尺为10mm。
[0162]
由图6可以得出：转化子的菌丝及孢子均能产生gfp荧光，表明gfp基因已成功转化至山茶炭疽菌中并获得表达。
[0163]
由以上实施例可以得出：采用本发明中的炭疽菌原生质体制备方法制备得到的原生质体数量多，质量好，且步骤简单；同时依次为基础成功快速构建了peg介导的炭疽菌遗传转化体系，且转化效率较高。
[0164]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。