基于酵母菌筛选昆虫P450酶杀虫剂底物及抑制剂的方法与流程

本发明属于重组表达的酶活性，具体来说涉及一种基于酵母菌筛选昆虫p450酶杀虫剂底物及抑制剂的方法。

背景技术：

1、细胞色素p450酶代表一类可自身氧化的亚铁血红素蛋白家族，又称细胞色素p450单加氧酶，广泛参与内源性物质和包括药物、杀虫剂及其他化合物的外源性物质的代谢。细胞色素p450酶起源于从动物到昆虫的各种生物，含有血红素作为辅助因子，并在450nm波长下有强吸收。研究表明p450是人体药物代谢过程的关键酶，同时也是昆虫对杀虫剂产生抗药性的主要代谢酶。当前普遍采用制备微粒体和全细胞生物转化这两种方法对p450介导的药物代谢进行研究，其中制备微粒体的方法需要一个长时间的离心过程，会导致酶的活性下降同时微粒体不可避免含有其他的p450酶，专一性不强。而在全细胞生物转化当中，反应中所需要的底物或抑制剂又不可避免地需要跨过一些生物屏障，例如细胞壁，细胞膜。大大降低了药物代谢的效率，不能真实客观的反映出酶与底物的关系。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种重组表达昆虫p450酶的酵母菌lxp450在筛选昆虫p450酶代谢杀虫剂底物或昆虫p450酶抑制剂中的应用。

2、本发明的另一目的是提供上述酵母菌lxp450的构建方法。

3、本发明的另一目的是提供上述构建方法获得的酵母菌lxp450。

4、本发明的另一目的是提供一种采用酵母菌lxp450制备的酶包。

5、本发明的另一目的是提供一种筛选荧光素底物作为筛选昆虫p450酶探针的方法。

6、本发明的另一目的是提供一种荧光素底物作为探针筛选昆虫p450酶代谢杀虫剂底物的方法。

7、本发明的另一目的是提供一种荧光素底物作为探针筛选昆虫p450酶抑制剂的方法。

8、本发明的另一目的是提供来曲唑/1-苄基咪唑作为抑制剂在减缓农业害虫对吡蚜酮/吡虫啉解毒中的应用。

9、本发明的另一目的是提供1-苄基咪唑作为抑制剂在减缓农业害虫对杀虫剂解毒中的应用。

10、本发明的另一目的是提供来曲唑作为抑制剂在减缓农业害虫对杀虫剂解毒中的应用。

11、本发明的目的是通过下述技术方案予以实现的。

12、一种重组表达昆虫p450酶的酵母菌lxp450在筛选昆虫p450酶代谢杀虫剂底物或昆虫p450酶抑制剂中的应用。

13、一种重组表达昆虫p450酶的酵母菌lxp450的构建方法，包括以下步骤：

14、s1.以昆虫p450基因为模板，进行pcr扩增，纯化，得到扩增纯化的pcr产物；利用pcr产物与第一载体构建载体负责表达昆虫p450；

15、在所述s1中，所述昆虫为鳞翅目(lepidoptera)昆虫、同翅目(homoptera)昆虫或鞘翅目(coleoptera)昆虫。

16、在上述技术方案中，所述同翅目(homoptera)昆虫为褐飞虱(nilaparvatalugens)、烟粉虱(bemisia tabaci)、黑刺粉虱(aleurocanthus spiniferus)、灰粉虱(laodelphax striatellus)、桑野蚕(bombyx mandarina)、桃蚜(myzus persicae)、菜蚜(lipaphis erysimi)、甘蓝蚜〔brevicoryne brassicae(linnaeus)，所述鳞翅目(lepidoptera)昆虫为草地贪夜蛾(spodoptera frugiperda)、大豆尺蠖(c.includens)、苹果蠹蛾(cydia pomonella)、斜纹夜蛾(spodoptera littoralis)、美洲棉铃虫(helicoverpa zea)、甘蔗螟虫(sugarcane borer)、烟芽夜蛾(heliothis virescens)、小菜蛾(plutella xylostella)、甜菜夜蛾(spodoptera.exigua)、蓓带夜蛾(mamestraconfigurata)、甘蓝夜蛾(mamestra brassicae)、黑切根虫(agrotis ipsilon)、西部切根虫(agrotis orthogonia)、颗粒夜蛾(a.subterranea)、木棉虫(alabama argillacea)、粉纹夜蛾(trichoplusia ni)、大豆夜蛾(pseudoplusia includens)、黎豆夜蛾(anticarsiagemmatalis)、苜蓿绿夜蛾(hypena scabra)、一星粘虫(pseudaletia unipuncta)、粗皮夜蛾(athetis mindara)、暗缘地老虎(euxoa messoria)、埃及金钢钻(earias insulana)、翠纹金钢钻(earias vittella)、谷实夜蛾(heliothis zea)、纹蝶毛虫(melanchra picta)或柑橘夜蛾(egira(xylomyges)curialis)；鞘翅目(coleoptera)昆虫为黄曲条菜跳甲(phyllotreta striolata)、东北大黑金龟子(holotrichia diomphalia)、黑绒金龟子(serica orientalis motschulsky)、铜绿丽金龟子(anomala corpulenta motschulsky)、华北大黑金龟子(holotrichia obilita falderma on)、马铃薯甲虫(coloradopotatobeetle)、甘薯小象甲(cylas formicarius)或谷斑皮蠹(trogoderma granarium)。

17、s2.将载体负责表达昆虫p450导入至表达细胞色素p450氧化还原酶的酵母菌的细胞中，培养，得到重组共表达细胞色素p450氧化还原酶和昆虫p450的酵母菌lxp450。

18、在上述技术方案中，昆虫p450包括cyp3集团、cyp4集团、线粒体cyp集团以及cyp2集团，其中，cyp3集团包括：cyp6、cyp9、cyp28家族、cyp308-310家族、cyp317家族、cyp321家族、cyp324家族、cyp329家族、cyp332家族、cyp336-338家族、cyp345-348家族、cyp354家族、cyp357-358家族、cyp365家族、cyp395-400家族、cyp408家族和cyp413家族；cyp4集团包括：cyp4、cyp311-313、cyp316家族、cyp318家族、cyp325家族、cyp340-341家族、cyp349-352家族、cyp380家族、cyp367家族、cyp405家族和cyp411-412家族；线粒体cyp集团包括：cyp12、cyp49、cyp301-302家族、cyp314-315家族、cyp333-334家族、cyp339家族、cyp353家族、cyp366家族；cyp2集团包括：cyp15、cyp18、cyp303-307家族、cyp343家族、cyp359家族和cyp369家族。

19、在所述s2中，所述酵母菌可为毕赤酵母、酿酒酵母或裂殖酵母。

20、上述构建方法获得的酵母菌lxp450。

21、在所述s2中，表达细胞色素p450氧化还原酶的酵母菌的细胞的构建方法包括以下步骤：

22、步骤1.以细胞色素p450氧化还原酶基因为模板，进行pcr扩增，纯化，利用细胞色素p450氧化还原酶基因所得pcr产物与第二载体构建负责表达细胞色素p450氧化还原酶的载体；

23、步骤2.将负责表达细胞色素p450氧化还原酶的载体导入酵母菌的细胞，得到表达细胞色素p450氧化还原酶的酵母菌的细胞。

24、一种采用酵母菌lxp450制备的酶包，其制备方法包括以下步骤

25、步骤1，挑取酵母菌lxp450涂布在第一培养基上，向第一培养基中添加亮氨酸和硫胺素，25～35℃培养36～72h，再将酵母菌lxp450转移到第二培养基内，于25～35℃继续培养36～72h；

26、在所述步骤1中，向第一培养基中添加终浓度为0.05～0.2g/l的亮氨酸和终浓度为5～10μm的硫胺素。

27、在上述技术方案中，所述第二培养基为液体爱丁堡基础培养基、yepd培养基、bmgy培养基或ypd培养基，所述第一培养基为琼脂和培养基的混合物，所述培养基与第二培养基相同，所述第一培养基中琼脂的浓度为10～40g/l。

28、步骤2，取步骤1所得酵母菌lxp450的细胞，收集细胞并重悬，于摇床渗透至少一小时，洗涤渗透后细胞多次，得到酶包。

29、在所述步骤2中，所述重悬采用tris-kcl缓冲液，洗涤渗透后细胞采用冰nh4hco3缓冲液。

30、一种筛选荧光素底物作为筛选昆虫p450酶的探针的方法，包括以下步骤：

31、将待筛选的每个荧光素底物分别准备成样品组，每个样品组为：将荧光素底物溶解在磷酸缓冲液中，得到荧光素前体混合物，荧光素前体混合物中荧光素底物的浓度为100～150μm，向荧光素前体混合物中加入酶包，添加nadph重生系统启动酶催化反应，30～40℃恒温反应至少3小时，离心，与荧光素检测试剂等体积混合，室温20～25℃孵育15～30min，得到样品组，其中，每个样品组包括两个样品，两个样品的酶包分别采用酵母菌lxp450制备的酶包和表达细胞色素p450氧化还原酶的酵母菌制备的酶包，用酶标仪测试一个样品组中两个样品的荧光强度，进行t检验，当p小于0.05时，该样品组的荧光素底物为筛选所得探针。

32、在上述技术方案中，添加等体积的nadph重生系统启动酶催化反应。

33、在上述技术方案中，每5mmol荧光素底物对应的荧光素前体混合物中所加入酶包的个数为至少5*107个。

34、在上述技术方案中，当p小于0.01时，该样品组的荧光素底物为筛选所得探针。

35、一种荧光素底物作为探针筛选昆虫p450酶代谢杀虫剂底物的方法，包括以下步骤：

36、将待筛选的每个杀虫剂分别准备成样品组，每个样品组为：将荧光素底物、磷酸钾缓冲液、杀虫剂水溶液和水混合，得到预反应体系，其中，杀虫剂水溶液为杀虫剂和水的混合物，向预反应体系中添加酶包并混匀，30～40℃恒温预孵育10～20分钟，添加nadph重生系统启动反应，30～40℃反应至少三小时，离心；所得上清液与等体积的萤光素检测试剂混合，室温20～25℃孵育20min，得到样品组，其中，每个样品组包括两个样品，两个样品的酶包分别为采用酵母菌lxp450制备的酶包和采用表达细胞色素p450氧化还原酶的酵母菌制备的酶包；

37、在一个样品组中，当采用酵母菌lxp450制备的酶包所得样品的荧光强度除以采用表达细胞色素p450氧化还原酶的酵母菌制备的酶包所得样品的荧光强度的值小于80％时该样品组所采用的杀虫剂为筛选所得昆虫p450酶代谢杀虫剂底物。

38、在上述技术方案中，预反应体系中杀虫剂的浓度为100μmol/l～1mmol/l。

39、在上述技术方案中，按体积份数计，荧光素底物、磷酸钾缓冲液、杀虫剂水溶液和水的比为(0.5～1.5)：(1～2)：(6～13)：(10～17)，添加等体积的nadph重生系统启动反应。

40、在上述技术方案中，每1.5μl荧光素底物所对应预反应体系中添加酶包的个数为至少5*107个。

41、在上述技术方案中，所述荧光素底物为ee、cee、fee、bue、pe、fbue或cpe。

42、一种荧光素底物作为探针筛选昆虫p450酶抑制剂的方法，包括以下步骤：

43、将待筛选的每个抑制剂分别准备成样品组，每个样品组为：将荧光素底物、磷酸钾缓冲液、抑制剂水溶液和水混合，得到预反应体系，向预反应体系中添加酶包并混匀，30～40℃恒温预孵育10～20分钟，添加nadph重生系统启动反应，30～40℃反应至少三小时，离心；所得上清液与等体积的萤光素检测试剂混合，室温20～25℃孵育20min，得到样品组；

44、每个样品组包括两个样品，两个样品的酶包分别为采用酵母菌lxp450制备的酶包和采用表达细胞色素p450氧化还原酶的酵母菌制备的酶包；

45、在一个样品组中，当采用酵母菌lxp450制备的酶包所得样品的荧光强度除以采用表达细胞色素p450氧化还原酶的酵母菌制备的酶包所得样品的荧光强度的值小于70％时该样品组所采用抑制剂为筛选所得昆虫p450酶抑制剂。

46、在上述技术方案中，预反应体系中抑制剂的浓度为10～100μmol/l。

47、在上述技术方案中，按体积份数计，荧光素底物、磷酸钾缓冲液、抑制剂水溶液、和水的比为(0.5～1.5)：(1～2)：(6～13)：(10～17)，添加等体积的nadph重生系统启动反应。

48、在上述技术方案中，每1.5μl荧光素底物所对应预反应体系中添加酶包的个数为至少5*107个。

49、在上述技术方案中，所述荧光素底物为ee、cee、fee、bue、pe、fbue或cpe。

50、上述表达细胞色素p450氧化还原酶的酵母菌制备的酶包的方法包括以下步骤：

51、步骤1，挑取表达细胞色素p450氧化还原酶的酵母菌涂布在第一培养基上，向第一培养基中添加亮氨酸，25～35℃培养36～72h，再转移到第二培养基内，于25～35℃继续培养36～72h；

52、在所述步骤1中，向第一培养基中添加终浓度为0.05～0.2g/l的亮氨酸。

53、步骤2，取步骤1所得酵母菌的细胞，收集细胞并重悬，于摇床渗透至少一小时，洗涤渗透后细胞多次，得到酶包。

54、在所述步骤2中，重悬采用tris-kcl缓冲液，洗涤渗透后细胞采用冰nh4hco3缓冲液。

55、1-苄基咪唑作为抑制剂在减缓农业害虫对杀虫剂解毒中的应用。

56、来曲唑作为抑制剂在减缓农业害虫对杀虫剂解毒中的应用。

57、在上述技术方案中，所述农业害虫为食叶类害虫、刺吸式害虫、蛀食性害虫或地下害虫。

58、在上述技术方案中，所述食叶类害虫为鳞翅目食叶类害虫、鞘翅目食叶类害虫或膜翅目食叶类害虫，鳞翅目食叶类害虫为袋蛾、刺蛾、大蚕蛾、尺蛾、螟蛾、枯叶蛾、舟蛾、美国白蛾、国槐尺蛾或凤蝶，鞘翅目食叶类害虫为叶甲，膜翅目食叶类害虫为叶蜂；

59、刺吸式害虫为蚜虫类、介壳虫类、粉虱类、木虱类、叶蝉类、蝽象类、蓟马类或叶螨类；

60、蛀食性害虫为鳞翅目的木蠹蛾科、透翅蛾科、鞘翅目的天牛科、小蠹科、吉丁甲科、象甲科、膜翅目的树蜂科或等翅目的白蚁；

61、地下害虫为直翅目的蝼蛄、蟋蟀、鳞翅目的地老虎、鞘翅目的蛴螬、金针虫或双翅目的种蝇。

62、在上述技术方案中，所述杀虫剂为吡啶类杀虫剂、三嗪酮类杀虫剂或新烟碱类杀虫剂。

63、1-苄基咪唑/来曲唑作为抑制剂在减缓农业害虫对吡虫啉解毒中的应用。

64、在上述技术方案中，1-苄基咪唑/来曲唑作为抑制剂的使用方法为：将抑制剂和吡虫啉混合使用，其中，按物质的量份数计，抑制剂和吡虫啉的比为1:(1～10)。

65、1-苄基咪唑/来曲唑作为抑制剂在减缓农业害虫对吡蚜酮解毒中的应用。

66、在上述技术方案中，1-苄基咪唑/来曲唑作为抑制剂的使用方法为：将抑制剂和吡蚜酮混合使用，其中，按物质的量份数计，抑制剂和吡蚜酮的比为1:(1～10)。

67、本发明借助酵母菌重组表达p450膜蛋白，利用细胞色素p450氧化还原酶高效的传递电子能力来辅助昆虫p450的功能性表达。通过去垢剂(tritonx-100)的渗透使细胞膜上形成若干个空隙，荧光素底物，杀虫剂及抑制剂小分子通过孔隙进入胞内被p450代谢，萤光素代谢产物与荧光素检测试剂混合输出荧光，通过候选化合物是否稳定显著地降低荧光素底物产生的冷光来判断是否为昆虫p450特异性的底物以及抑制剂。

68、该酶包系统帮助荧光素底物，杀虫剂及抑制剂小分子摆脱生物屏障的阻碍，自由进入胞内与重组表达的蛋白在体内相互作用，避免了长时间的分级离心过程，而相比于现有技术更加真实地模拟酶在体内所处的自然状态以及与小分子相互作用的模式，且专一性更强，借助荧光素底物与荧光素检测试剂20分钟就可以表征酶活性和避免了冗长的超离过程，使得整个系统相较于传统方法更加高效快速地去筛选特定昆虫p450的代谢底物及抑制剂。