一种表达猫疱疹病毒蛋白的mRNA疫苗及其制备方法

本发明涉及核酸疫苗领域，具体而言涉及一种表达猫疱疹病毒蛋白的mrna疫苗及其制备方法。

背景技术：

1、猫病毒性鼻气管炎(fvrs)，又称猫传染性鼻气管炎，是由猫疱疹病毒(felineherpesvirus，fhv)感染引起猫的一种急性、高度接触性传染病。fhv感染的典型临床症状是体温升高、打喷嚏、咳嗽、角膜结膜炎、鼻眼浆液性或脓性分泌物和眼周皮肤溃疡。在幼猫和成年猫中均可发生，主要感染2-4个月龄，发病率高达100％，成年猫不引起死亡，幼猫死亡率可达50％，是目前已知最严重的猫呼吸道疾病之一。1957年crandell r.a于美国首次在患病幼猫体内分离得到fhv。随后在越南、荷兰、英国、日本、匈牙利等地分离到此病。之后我国多次检测并分离到该病毒，该病在我国呈上升趋势。受感染的猫会建立潜伏期，病毒粒子会潜伏于猫的三叉神经节和视神经节内等部位，在外界环境的刺激下容易引发再次感染，且间歇性向外排毒，不利于该病的防控。fhv属于属疱疹病毒科(herpesviridae)、α-疱疹病毒亚科(alpha herpesvirinae)、水痘疱疹病毒属(varicellovirus)成员，病毒粒子为有囊膜包裹、直径约为128-168nm的球形粒子。fhv是基因组长约126-134kb的线性双股dna病毒。基因组是典型的d型dna分子结构，由1个99kbp的长独特区(ul)和1个27kbp的短独特区(us)组成，共包含78个开放型阅读框，ul区含有63个，us区含有12个，共编码74种蛋白质。其中gb、gc、gd、ge、gg、gh和gi 7种糖蛋白已得到鉴定，他们在病毒识别、侵入、导致感染，在细胞间传播和感染释放中发挥着重要作用。

2、gb蛋白是由ul27基因编码的949个氨基酸组成的囊膜糖蛋白，是fhv囊膜表面的重要组成部分，同时gb糖蛋白也是最主要的免疫抗原性蛋白，对于病毒入侵细胞、病毒复制、细胞融合以及在细胞间传播起着决定性作用。gb蛋白是疱疹病毒中高度保守的结构蛋白，其氨基酸序列比对分析结果表明，fhv与α-疱疹病毒亚科的其他成员具有较高的同源性，但不同病毒株之间存在一定的抗原差异gb主要介导病毒与宿主细胞的融合以及多核体的形成，与gc结合形成的糖蛋白复合物可以特异性识别宿主细胞肝素样受体。同时gb蛋白是可以刺激机体产生高水平的中和抗体、补体介导的抗体依赖性细胞溶解、抗体依赖性细胞毒性的靶抗原。

3、gd蛋白是病毒囊膜的主要成分，存在于感染的细胞膜上，具有高度的保守性和抗原性，能够与细胞表面的分子特异性结合。诱导机体产生细胞免疫和体液免疫，在病毒穿入易感细胞中起重要作用，是宿主细胞免疫和体液免疫反应的主要靶细胞之一。gd蛋白具有血凝特性，能产生血凝于血凝抑制反应。gd糖蛋白被认为是病毒粒子表面和病毒感染细胞的主要分子，此糖蛋白的单克隆抗体在病毒吸附后中和病毒，并显示出较高的中和效价，表明gd可能参与病毒进入细胞，并为病毒复制的必需基因。gd蛋白也是极为保守的免疫原性蛋白，作为研究疱疹病毒亚单位疫苗常选择的靶蛋白，具有较好的免疫原性。

4、相比传统疫苗，mrna疫苗作为新型疫苗的形式，具有生产工艺简单、开发速度快、无需细胞培养、成本低。相较与dna疫苗，mrna疫苗无需进入细胞核，没有整合至宿主基因组的风险，半衰期可以通过修饰进行调整。mrna疫苗可提供对适应性和先天免疫力的综合刺激，即原位抗原表达和危险信号传递；可以诱导“平衡”免疫反应，包括体液和细胞效应因子以及免疫记忆。

技术实现思路

1、本发明针对现有猫疱疹病毒疫苗产品中存在的不足，提供了一种预防或治疗的猫病毒性鼻气管炎病的表达猫疱疹病毒蛋白的mrna疫苗制备方法及其应用，所述猫疱疹病毒蛋白为猫疱疹病毒gb蛋白或猫疱疹病毒gd蛋白。

2、本发明的技术方案：

3、一种重组mrna合成质粒，包括质粒骨架序列、编码猫疱疹病毒gb蛋白的基因或编码猫疱疹病毒gd蛋白的基因；所述编码猫疱疹病毒gb蛋白的基因序列如seq id no.1所示，所述编码猫疱疹病毒gd蛋白的基因序列如seq id no.2所示；所述编码猫疱疹病毒gb蛋白的基因为缺失3’端第2440-2847位核苷酸序列，所述编码猫疱疹病毒gd蛋白的基因为缺失3’端第988-1125位核苷酸序列。

4、其中，猫疱疹病毒(feline herpesvirus，fhv)属于疱疹病毒科病毒(herpesviridae)，主要侵害2-4月龄幼猫，引起角膜结膜炎、鼻眼浆液性或脓性分泌物和眼周皮肤溃疡为主要症状。

5、其中，fhv的gb蛋白是最主要的免疫抗原性蛋白，是主要的抗体免疫点。由于gb蛋白属于跨膜蛋白，结构包含胞外区、跨膜区和胞内区，其中跨膜区和胞内区位于gb的羧基末端，不利于蛋白的可溶性表达，为此对gb蛋白基因第2440-2847位核苷酸序列进行缺失改造。fhv的gd蛋白是最主要的免疫抗原性蛋白，是主要的抗体免疫点。由于gd蛋白属于跨膜蛋白，结构包含胞外区、跨膜区和胞内区，其中跨膜区和胞内区位于gd的羧基末端，不利于蛋白的可溶性表达，为此对gd蛋白基因第988-1125位核苷酸序列进行缺失改造。

6、所述质粒骨架序列包括t7启动子序列、5’utr区、3’utr区和3’末端polya尾。重组mrna合成质粒可构建于任意克隆载体，polya尾末端保留一个bsa i限制性内切酶位点，用于质粒线性化制备。

7、优选的，所述限制性内切酶位点为bspq i、bsa i或mlu i。

8、还包括甲病毒非结构蛋白基因编码区；所述甲病毒非结构蛋白基因编码区为非结构蛋白1-4基因编码区，编码猫疱疹病毒gb蛋白基因序列或编码猫疱疹病毒gd蛋白基因序列经过密码子优化；优选地，所述甲病毒为委内瑞拉马脑炎病毒(vee)。vee复制酶基因nsp1-4区，包含vee病毒复制酶基因序列，表达的vee病毒复制酶能够在体内合成mrna，起到复制mrna的功能。

9、本发明还提供了所述的重组mrna合成质粒在制备预防猫疱疹病毒引起的猫病毒性鼻气管炎病的疫苗中应用。

10、本发明还提供了一种表达猫疱疹病毒蛋白的mrna，包括5’utr区、3’utr区和3’末端polya尾、编码猫疱疹病毒gb突变蛋白或猫疱疹病毒gd突变蛋白的mrna；所述猫疱疹病毒gb突变蛋白和猫疱疹病毒gd突变蛋白为缺失改造，猫疱疹病毒gb突变蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示，所述猫疱疹病毒gd突变蛋白的氨基酸序列如seq id no.4所示。

11、还包括委内瑞拉马脑炎病毒复制酶1-4编码区的mrna。

12、优选的，还包含5’帽结构，所述5’帽结构为7-甲基鸟苷帽结构。

13、其中，表达gb蛋白的基因mrna序列大小为2704bp(序列如seq id no.5所示)，表达gb蛋白基因复制型mrna序列大小为10215bp(序列如seq id no.7所示)。表达gd蛋白的基因mrna序列大小为1186bp(序列如seq id no.6所示)，表达gd蛋白基因复制型mrna序列大小为8697bp(序列如seq id no.8所示)

14、本发明还提供了一种表达猫疱疹病毒蛋白的mrna疫苗，包含所述表达猫疱疹病毒蛋白的mrna。

15、目前，mrna疫苗主要以两种序列结构存在，传统的非复制型mrna序列和自扩增型(复制型)的mrna疫苗序列。自扩增型mrna序列含有复制酶基因，可在细胞内扩增mrna，从而以较少的mrna剂量生产较多的抗原。非复制型的mrna疫苗结构简单，在人体内无法自我复制，需要成熟的优化工艺才能在较低的剂量诱发有效的免疫应答。

16、本发明还提供了所述的mrna疫苗的制备方法，将所述表达猫疱疹病毒蛋白的mrna与阳离子脂质、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、聚乙二醇脂质和胆固醇混合制备成脂质纳米颗粒，通过微流控装置或混合透析后获得所述复制型mrna疫苗。

17、具体步骤为：

18、(1)将所述重组mrna合成质粒t7-gb或t7-gd使用限制性内切酶进行线性化处理；

19、(2)对线性化的t7-gb或t7-gd质粒利用t7启动子序列进行体外转录反应，提纯获得gb-mrna或gd-mrna；

20、(3)对获得gb-mrna或gd-mrna使用牛痘病毒加帽酶和2′-o-甲基转移酶通过酶法进行cap加帽修饰反应，提纯获得cap-gb-mrna或cap-gd-mrna；

21、(4)加帽修饰的cap-gb-mrna或cap-gd-mrna与阳离子脂质(sm-102)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(dspc)、胆固醇、聚乙二醇脂质(dmg-peg2000)按照比例通过微流控装置或混合透析后获得lnp-gb-mrna或lnp-gd-mrna疫苗。

22、本发明还提供了所述猫疱疹病毒gb蛋白或猫疱疹病毒gd蛋白的mrna疫苗作为预防猫疱疹病毒感染中的应用。使用lnp-gb-mrna或lnp-gd-mrna疫苗免疫后的动物体内存在针对猫疱疹病毒gb蛋白或猫疱疹病毒gd蛋白的特异性抗体，具有预防猫疱疹病毒感染的作用。

23、本发明的有益效果：

24、本发明制备了一种表达猫疱疹病毒gb蛋白或猫疱疹病毒gd蛋白的mrna疫苗，构建包含猫疱疹病毒gb蛋白或猫疱疹病毒gd蛋白的mrna载体质粒，并用于制备mrna，结合脂质体包裹方案制备mrna疫苗，并应用于猫疱疹病毒的免疫。该方法在猫疱疹病毒研究和疫苗创制上具有应用价值，能够大力推进疫苗的转化应用。