一种高产植物鞘氨醇的酿酒酵母菌株

(一)本发明涉及一种提高酿酒酵母植物鞘氨醇产量的方法。植物鞘氨醇作为药物、化妆品等的成分在工业上具有广泛应用。

背景技术：

0、(二)背景技术

1、酿酒酵母具有遗传操作简便、生物安全性高和发酵稳定等优点，是一种应用广泛的生物细胞工厂。植物鞘氨醇，是一种神经鞘氨醇类化合物，其既是一类最简单的鞘脂类化合物，又是其他鞘脂化合物的主干部分(长链碱基部分)，是鞘脂化合物的特征结构。植物鞘氨醇在应用于化妆品中，既有可以对位于人体和其他皮肤组织中的双链多脂脂质层细胞进行皮肤渗透性功能改善的基础同时，又同样可以在该亲水层上直接形成一个亲水屏障，具有人体防护和皮肤保水的重要作用。

2、目前鞘脂类的获取方式主要有合成法以及微生物发酵法。植物中魔芋提取的神经酰胺含量为其他植物的十几倍。但植物提取方法受植物生长周期和季节的限制，产量较低。动物中来源于有致病风险的动物脑部，所以不可应用于化妆品中。而化学合成的主要是拟神经酰胺，其结构与神经酰胺相似，功能相似，可应用于化妆品中，目前已有多种拟神经酰胺成功合成，爱茉莉太平洋公司目前已生产出一种新型拟神经酰胺，提高了其溶解度和稳定性，其技术路线是将三羟甲基氨基甲烷溶于二甲基甲醛(dmf)，再溶于三乙胺(et3n)，30min后加入棕榈酰氯经过一系列反应再引入脂肪酸。但因为在化妆品中应用的植物鞘氨醇主要从动植物中提取。显然，在工业水平上是一种成本很高的方法。化学合成法由于步骤繁琐，副产物较多，合成率较低等缺点，难以实现工业化生产。生物发酵法外界干扰因素较少，可大量生产且降低植物鞘氨醇的价格，更利于其在产品中的广泛应用。

3、微生物发酵法是近年来的常用制备神经酰胺的方法，即应用毕赤酵母(pichiaciferrii)或酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)在一定环境下发酵得到四乙酰植物鞘氨醇(schorsch，et al.(2012)metabolic engineering.14(2)172-184)再对其去乙酰化得到植物鞘氨醇(kim，et al.(2010)journal of microbiology andbiotechnology.20(2)356-62)。markus schwab等在酿酒酵母合成植物鞘氨醇，摇瓶产量达到70mg/l(us2018-0179562)。

4、本发明以酵母工程菌中植物鞘氨醇的合成为例，改造鞘脂类的代谢途径，并且创新性地发现增强转录因子hac1可以显著提高酵母的植物鞘氨醇产量434％，为提高酵母鞘脂类的生产提供了一种简便有效的方法。

技术实现思路

0、(三)
技术实现要素：

1、本发明目的是提供一种提高酿酒酵母植物鞘氨醇产量的方法，根据已知生产植物鞘氨醇的代谢途径，敲除分支代谢途径产物的基因，并在敲除基因的靶点上融合强启动子增强目的产物的基因表达，并高表达转录因子hac1的编码基因，进一步提高酵母植物鞘氨醇的合成。

2、本发明采用的具体技术方案是：

3、第一方面，本发明提供一种高产植物鞘氨醇的酿酒酵母菌株，所述高产植物鞘氨醇的酿酒酵母菌株以酿酒酵母cen.pk2-1d为出发菌株进行如下改造得到：敲除lcb4(鞘氨醇碱激酶)基因、shm2(丝氨酸羟甲基转移酶)基因和cha1(l-丝氨酸脱氨酶)基因，在orm2(丝氨酸棕榈酰基转移酶活性的膜蛋白)基因位点插入3-脱氢二氢神经鞘氨醇还原酶(tsc10)基因的表达盒，在elo3(脂肪酸延长酶iii)基因位点插入鞘氨醇羟化酶(syr2)基因的表达盒，在shm1(丝氨酸羟甲基转移酶)基因的位点插入丝氨酸棕榈酰基转移酶(lcb2)基因的表达盒，在所述高产植物鞘氨醇的酿酒酵母菌株pt06的delta 22位点上插入转录因子hac1基因的表达盒，得到高产植物鞘氨醇的酿酒酵母菌株。

4、在本发明的一个实施例中，所述3-脱氢二氢神经鞘氨醇还原酶(tsc10)基因的表达盒包括tdh3启动子和3-脱氢二氢神经鞘氨醇还原酶(tsc10)基因，所述tdh3启动子的核苷酸序列如seq id no：1所示。

5、进一步，所述3-脱氢二氢神经鞘氨醇还原酶(tsc10)基因的核苷酸序列如seq idno：3所示。

6、在本发明的一个实施例中，所述鞘氨醇羟化酶(syr2)基因的表达盒包括tdh3启动子和鞘氨醇羟化酶(syr2)基因，所述tdh3启动子的核苷酸序列如seq id no：1所示。

7、进一步，所述鞘氨醇羟化酶(syr2)基因的核苷酸序列如seq id no：4所示。

8、在本发明的一个实施例中，所述丝氨酸棕榈酰基转移酶(lcb2)基因的表达盒包括tdh3启动子和丝氨酸棕榈酰基转移酶(lcb2)基因，所述tdh3启动子的核苷酸序列如seq idno：1所示。

9、进一步，所述丝氨酸棕榈酰基转移酶(lcb2)基因的核苷酸序列为seq id no：5所示。

10、在本发明的一个实施例中，所述转录因子hac1基因的表达盒包括tdh3启动子和转录因子hac1基因，所述tdh3启动子的核苷酸序列如seq id no：1所示。

11、进一步，所述转录因子hac1基因的核苷酸序列如seq id no：6所示。

12、进一步，所述改造采用crispr-cas9酵母基因组编辑方法完成。利用grna表达盒，与同时转化的另一个完整的出发载体在酵母体内发生同源重组，在敲除lcb4(鞘氨醇碱激酶)基因、shm2(丝氨酸羟甲基转移酶)基因、cha1(l-丝氨酸脱氨酶)基因后，并在orm2(丝氨酸棕榈酰基转移酶活性的膜蛋白)基因位点插入强启动子tdh3驱动的tsc10(3-脱氢二氢神经鞘氨醇还原酶)基因；在elo3(脂肪酸延长酶iii)基因位点插入强启动子tdh3驱动的syr2(鞘氨醇羟化酶)基因；在shm1(丝氨酸羟甲基转移酶)基因的位点插入强启动子tdh3驱动的lcb2(丝氨酸棕榈酰基转移酶)基因以及在基因组dleta 22位点上使用强启动子tdh3高表达hac1基因，植物鞘氨醇产量有显著提高。

13、进一步，所述grna表达盒依次由上游同源臂、靶标序列、grna scaffold片段和下游同源臂组成；所述上游同源臂和下游同源臂分别与出发载体有60bp以上的相同序列；所述靶标序列是根据酿酒酵母基因组上靶位点基因，利用chopchop网站，设计20bp的靶标序列。

14、进一步，所述grna靶点表达盒为7个。

15、进一步，所述grna scaffold片段核苷酸序列如seq id no：2所示。

16、进一步，所述靶位点包括lcb4、shm2、cha1、orm2、elo3、shm1、delta22。

17、其中靶位点lcb4的靶标序列为：ttatagaagacccgacagag；

18、靶位点shm2的靶标序列为：ggtctatacctaccagatgg；

19、靶位点cha1的靶标序列为：gtagataaaatcaggaacac；

20、靶位点orm2的靶标序列为：tcccaacatgaacgctacgt；

21、靶位点elo3的靶标序列为：atccaatcttacaagaaagg；

22、靶位点shm1的靶标序列为：tactccgctatcatgaacgt；

23、靶位点delta22的靶标序列为：tgttaattcctacatactcg。

24、所述酿酒酵母菌基因编辑方法是将植物鞘氨醇代谢相关基因lcb4、shm2、cha1三个靶点进行敲除以及在orm2、elo3、shm1同时插入酿酒酵母基因组中tsc10、syr2、lcb2编码基因的3个靶位点，逐步增强植物鞘氨醇合成途径。

25、进一步，所述方法为：首先分别构建靶位点lcb4、shm2、cha1、orm2、elo3、shm1、delta22的grna表达盒，与出发载体和供体dna片段，同时转化未经改造cas9质粒。

26、进一步，所述出发载体为p426-snr52p-grna.can1.y-sup4t(addgene公司#43803)，简称p426载体。

27、所述hac1基因的过表达按如下方法进行：在基因组delta 22位点上插入启动子tdh3驱动的hac1基因。

28、另外，本发明还提供一种上述高产植物鞘氨醇的酿酒酵母菌株在发酵制备高产植物鞘氨醇中的应用。

29、所述发酵的条件为：温度30℃，时间48-120h(优选为96h-120h，转速200rpm。

30、进一步，所述发酵在ypd液体培养基中进行，所述ypd液体培养基由以下浓度的各组分组成：酵母粉10g/l、蛋白胨20g/l、葡萄糖20g/l，溶剂为去离子水，ph自然。

31、所述酿酒酵母为酵母cen.pk2-1d(euroscarf公司，德国)。

32、另外，所述发酵还可以采用发酵罐进行。

33、本发明为了提高植物鞘氨醇的产量，首先筛选最高产植物鞘氨醇的酿酒酵母菌株cen.pk2-1d作为原始菌株。

34、与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明在高产植物鞘氨醇的酿酒酵母的基础上，构建高效合成植物鞘氨醇的酿酒酵母工程菌株，将lcb4、shm2、cha1、orm2、elo3、shm1基因编码的蛋白质的表达降低和利用组成型启动子将tsc10、syr2、lcb2基因编码蛋白质的表达提高，植物鞘氨醇摇瓶量达到9.52mg/g干重，再通过组成型启动子将hac1基因编码蛋白质的表达提高，植物鞘氨醇摇瓶量进一步提高了4.34倍，达到41.33mg/g干重，植物鞘氨醇产量达到为目前报道的摇瓶发酵最高产量。5l发酵罐发酵产植物鞘氨醇的产量达到了150.54mg/g干重，滴度为2817mg/l。