一种无支架3D细胞球结构皮肤器官的构建方法与流程

本发明属于皮肤组织，尤其涉及一种无支架3d细胞球结构皮肤器官的构建方法。

背景技术：

1、皮肤是人体最大的器官，大体分为三个部分，即由最外侧的表皮层、其下层的真皮层以及皮下组织所构成。它是外界环境与内部器官之间的重要屏障，可以防止身体水分的流失、环境影响、伤害或感染等，而且有助于调节体温。传统的皮肤研究采用动物模型，但随着各项规定的出台及研究平台的发展，应用皮肤组织工程构建皮肤模型模拟天然皮肤，代替动物进行相关安全性测试已成为一种趋势。皮肤模型在不同领域均有广泛应用，如在制药领域，通常使用皮肤模型研究药物的作用机理、发病机制、毒性影响等，因此需要开发具有模拟天然皮肤结构的人造皮肤。

2、然而，动物实验不能准确反应人体对于药物和材料的毒性和功效。而传统的2维细胞培养也跟实际的体内生理环境有很大的差异。与2d单层生长的贴壁细胞相比，3d细胞球生长条件被认为可以更真实地反映细胞生长的生理环境。因此科学研究需要体外3维人体细胞模型来更准确的模拟人体的环境，提高研究人体疾病，或筛选药物和材料的毒性和功效的效率。如陈灿等(混合接种法构建组织工程皮肤[j].中华整形外科杂志,2010,26(5):365-368.doi:10.3760/cma.j.issn.1009-4598.2010.05.013.)研究了混合接种法体外构建复合皮的可行性，其在脱细胞真皮的真皮面接种成纤维细胞后，将表皮细胞与成纤维细胞混合后接种于表皮面，培养三周后可见表皮层连续，基底膜形成。苏浩(苏浩.利用人表皮干细胞和成纤维细胞3d打印皮肤组织的初步研究[d].江苏:扬州大学,2020.)利用人表皮干细胞和成纤维细胞3d打印皮肤组织，以纤维蛋白原和明胶为支架材料，epscs和成纤维细胞为种子细胞，微挤压打印真皮层和表皮层，凝血酶交联。但虽然已有如上所述的多款3d皮肤模型，以及法国t—skin、美国epiderm ft、德国phenionft以及中国fulkutis，但是这些商用模型都使用了胶原、壳聚糖凝胶等支架材料或插入式培养器，操作复杂，成本高。

3、细胞球为多细胞3d结构，可模拟体内细胞应答和相互作用。它们具有高度可重复性，适合高通量筛选，且无需任何支架材料。而目前尚无关于采用3d细胞球技术构建皮肤类器官的报道。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供了一种无支架3d细胞球结构皮肤器官的构建方法，以3d细胞球技术为基础模拟了人体皮肤上皮层和真皮层的结构，可以作为一种体外皮肤模型平台，用于药物或材料进行快速高通量的筛选或鉴定。而且这种方法非常高效稳定，可以根据需要低成本一次生产10-10000个进行实验。

2、本发明的第一个目的是提供一种无支架3d细胞球结构皮肤器官的构建方法，包括以下步骤：

3、s1、分别制备上皮细胞悬浮液和成纤维细胞悬浮液；

4、s2、将上皮细胞悬浮液和成纤维细胞悬浮液混合，进行3d培养，使上皮细胞和成纤维细胞自组装成具有双层结构的细胞球，得到所述无支架3d细胞球结构皮肤器官。

5、进一步地，上皮细胞悬浮液通过上皮细胞和上皮细胞培养液混合得到。

6、进一步地，成纤维细胞悬浮液通过成纤维细胞和成纤维细胞培养液混合得到。

7、进一步地，上皮细胞悬浮液的浓度为104～108个细胞/毫升。

8、进一步地，成纤维细胞悬浮液的浓度为104～108个细胞/毫升。

9、进一步地，上皮细胞悬浮液和成纤维细胞悬浮液按体积比1:3～15混合。

10、进一步地，所述具有双层结构的细胞球中，内层为成纤维细胞，外层为上皮细胞。

11、本发明的第二个目的是提供上述构建方法构建得到的无支架3d细胞球结构皮肤器官。

12、本发明的第三个目的是提供一种体外皮肤模型，包括上述无支架3d细胞球结构皮肤器官。

13、本发明的第四个目的是提供上述无支架3d细胞球结构皮肤器官或体外皮肤模型在制药领域或化妆品领域的应用，如作为药物筛选、毒性评价等的皮肤模型。

14、本发明的有益效果：

15、本发明针对现有动物实验和传统的2维细胞培养与实际的人体内生理环境有很大的差异，不能准确反应人体对于药物和材料的毒性和功效，且传统3维皮肤器官制备繁琐的缺陷，提供了一种体外无支架人源皮肤类器官的高效构建方法，模拟了人体皮肤上皮层和真皮层的结构，它可以作为一种体外疾病模型平台，比如常见的湿疹、痤疮，纤维瘤等皮肤疾病，也可以用于药物或材料进行快速高通量的筛选或鉴定。这将有助于更好地了解感染、免疫反应、药物或材料对皮肤影响的机理。

技术特征：

1.一种无支架3d细胞球结构皮肤器官的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：上皮细胞悬浮液通过上皮细胞和上皮细胞培养液混合得到。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：成纤维细胞悬浮液通过成纤维细胞和成纤维细胞培养液混合得到。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：上皮细胞悬浮液的浓度为104～108个细胞/毫升。

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：成纤维细胞悬浮液的浓度为104～108个细胞/毫升。

6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：上皮细胞悬浮液和成纤维细胞悬浮液按体积比1:3～15混合。

7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述具有双层结构的细胞球中，内层为成纤维细胞，外层为上皮细胞。

8.权利要求1-7任一项所述的构建方法构建得到的无支架3d细胞球结构皮肤器官。

9.一种体外皮肤模型，其特征在于：权利要求8所述的无支架3d细胞球结构皮肤器官。

10.权利要求8所述的无支架3d细胞球结构皮肤器官或权利要求9所述的体外皮肤模型在制药领域或化妆品领域的应用。

技术总结
本发明公开了一种无支架3D细胞球结构皮肤器官的构建方法，将人源上皮细胞和成纤维细胞按照一定比例混合，进行3D培养，这两种细胞会自组装形成类似皮肤的细胞结构，外面是上皮层，内部是真皮层。本发明制备的皮肤器官模拟了人体皮肤上皮层和真皮层的结构，可以作为一种体外皮肤模型平台，用于药物或材料进行快速高通量的筛选或鉴定，具有巨大的应用前景。

技术研发人员：谭禹,文学军,邵漠宇,张浩
受保护的技术使用者：泛领生物医学技术（苏州）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11