一种流感病毒疫苗的制作方法

本发明涉及生物，尤其涉及一种流感病毒疫苗。

背景技术：

1、流行性感冒(简称流感)是一种由流感病毒引起的急性呼吸道传染病。流感病毒容易发生变异，传染性强，人群普遍易感，发病率高，历史上在全世界引起多次暴发性流行，是全球关注的重要公共卫生问题。据世界卫生组织(who)统计，每年季节性流感可造成约65万人死亡。

2、流感病毒属正粘病毒科，为单股、负链、分节段rna病毒。根据核蛋白和基质蛋白不同，分为甲、乙、丙、丁四型。流感病毒呈球形，新分离的毒株则多呈丝状，其直径在80至120nm之间，丝状流感病毒的长度可达4000纳米。流感病毒结构自外而内可分为包膜、基质蛋白以及核心三部分。

3、流感病毒变异有抗原性变异、温度敏感性变异、宿主范围以及对非特异性抑制物敏感性等方面的变异，但最主要的是抗原性变异。抗原性变异与其他病毒不同，特点是表面抗原ha和na易变异。变异有两种形式，即抗原性转变和抗原性漂移。

4、抗原性转变(antigenic shift)变异幅度大，属于质变，即病毒株表面抗原结构一种或两种发生变异，与前次流行株抗原相异，形成新亚型(如h1n1→h2n2、h2n2→h3n2)，由于人群缺少对变异病毒株的免疫力，从而引起流感大流行。如果两种不同病毒同时感染同一细胞，则可发生基因重组形成新亚型。

5、抗原性漂移(antigenic drift)变异幅度小或连续变异，属于量变，即亚型内变异。一般认为这种变异是由病毒基因点突变和人群免疫力选择所造成的，所引起的流行是小规模的。

6、who于每年2月和9月召开专家技术磋商会议，推荐用于北半球和南半球流行性感冒(流感)季节的流感疫苗病毒株成分。但人们无法准确预测即将流行的病毒亚型，另一方面，每隔十数年便会发生地抗原转变更会产生根本就没有疫苗的流感新毒株。

7、目前，有多种抗病毒药物用于治疗人类季节性流感，但耐药性日趋严重，接种疫苗成为预防流感最有效的方法。现如今的主流流感疫苗为三价/四价流感病毒裂解疫苗，分别预防h1n1、h3n2及一种或两种b型流感病毒感染，该类疫苗基于每年who预测的毒株进行生产，仅能预防当下流感季的流感病毒，然而预测可能存在不确定性导致不能有效预防流感病毒感染，因此，急需一种预防效果好、相对广谱的流感疫苗。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种流感病毒疫苗。本发明提供的核酸疫苗对a型、b型流感的多种亚型流感病毒株均具有良好的中和活性，具有较高的保守性和广谱性。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、一种重组抗原蛋白，包括np、ha2、na、m1中至少一种流感病毒抗原蛋白或其免疫原性蛋白片段以及表位模块；

4、所述流感病毒抗原蛋白或其免疫原性蛋白片段具有i)～ii)所示的至少一种序列：

5、i)、如seq id no：1～38任一所示的氨基酸序列；

6、ii)、与seq id no：1～38任一所示的氨基酸序列至少具有70％以上的同一性且功能相同或相似的氨基酸序列；

7、所述表位模块具有iii)～iv)所示的至少一种序列：

8、iii)、如seq id no：42～46任一所示的氨基酸序列；

9、iv)、与seq id no：42～46任一所示的氨基酸序列至少具有70％以上的同一性且功能相同或相似的氨基酸序列。

10、一些实施方案中，所述流感病毒抗原蛋白或其免疫原性蛋白片段的氨基酸序列与seq id no：1～38任一所示的氨基酸序列具有至少70％同一性，包括70％与100％之间(包括端值)的任何数值，例如70％、80％、85％、90％、95％、99％和100％)，以上抗原蛋白或其免疫原性蛋白片段包括与seq id no：1～38所示的氨基酸序列具有大于95％同一性或大于98％同一性的变体。

11、一些实施方案中，所述表位模块的氨基酸序列与seq id no：42～46任一所示的氨基酸序列具有至少70％同一性，包括70％与100％之间(包括端值)的任何数值，例如70％、80％、85％、90％、95％、99％和100％)，以上抗原蛋白或其免疫原性蛋白片段包括与seq idno：42～46所示的氨基酸序列具有大于95％同一性或大于98％同一性的变体。

12、一些实施方案中，所述的重组抗原蛋白，包括：

13、以任意顺序连接的流感病毒抗原蛋白ha2、na、m1和表位模块，或任意顺序连接的所述ha2、na、m1三种蛋白的免疫原性蛋白片段和表位模块；或

14、以任意顺序连接的np蛋白或其免疫原性蛋白片段，以及表位模块；或

15、以任意顺序连接的流感病毒抗原蛋白ha2、na、m1、np和表位模块，或以任意顺序连接的所述np、ha2、na、m1四种蛋白的免疫原性蛋白片段和表位模块。

16、一些实施方案中，所述流感病毒抗原蛋白np的氨基酸序列如seq id no：7、18、28或38所示；

17、所述ha2蛋白的氨基酸序列如seq id no：1、4、8、10、12、15、19、22、25、29、32或35所示；

18、所述na蛋白的氨基酸序列如seq id no：2、5、9、11、13、16、20、23、26、30、33或36所示；

19、所述m1蛋白的氨基酸序列如seq id no：3、6、14、17、21、24、27、31、34或37所示。

20、ha2蛋白中还可以添加功能性基序片段，基序片段在ha2蛋白中用于辅助形成三聚体结构，包括但不限于t4噬菌体次要纤维蛋白(foldon)、gcn4、mtq。本发明中，所述ha2蛋白还包含氨基酸序列如seq id no39～41所示的基序片段。

21、本发明中，所述流感病毒抗原蛋白np、ha2、na、m1之间、所述流感病毒抗原蛋白与表位模块之间以及所述流感病毒抗原蛋白的免疫原性蛋白片段与表位模块之间均通过自剪切序列相连。对np、ha2、na、m1蛋白或其免疫原性蛋白片段以及表位模块之间的连接顺序不作限定。所述自剪切序列为p2a、t2a、e2a或f2a中至少一种。一些具体实施例中，所述p2a、t2a、e2a和f2a的氨基酸序列依次如seq id no：139～142所示，包括但不仅限于此。

22、本发明中，所述表位模块包含多个抗原表位，每个表位的拷贝数为1个以上，所述表位模块中相同抗原表位之间以及不同抗原表位之间均由linker相连。其中，所述linker的氨基酸序列包括但不仅限于aaapgaa。

23、本发明还提供了所述重组抗原蛋白的核酸分子；所述核酸分子包括dna和/或mrna。

24、本发明中，所述核酸分子包括：

25、编码所述i)或ii)中至少一种流感病毒抗原蛋白或其免疫原性蛋白片段的核酸片段，或

26、编码所述iii)或iv)中至少一种表位模块的核酸片段。

27、一些实施方案中，所述核酸分子中任意一种核酸片段为经过人类偏好密码子优化的核酸片段，根据人类密码子的偏好性进行优化获得。

28、一些实施方案中，所述核酸分子为mrna，所述核酸分子的序列包括：

29、a)、如seq id no：47-seq id no：84所示的至少一种核苷酸序列、seq id no：85-seq id no：87所示的至少一种核苷酸序列和如seq d no：88-seq id no：92所示的至少一种核苷酸序列；

30、b)与a)所示的核苷酸序列编码相同的蛋白，但因遗传密码的简并性而与a)的核苷酸序列不同的核苷酸序列；

31、c)编码与a)或b)所示的核苷酸序列编码的蛋白具有75％以上同一性的蛋白变体的核苷酸序列。

32、其中，seq id no：47-seq id no：84中seq id no：47、50、54、56、58、61、65、68、71、75、78或81所示的ha2蛋白的mrna片段的3’端还连接有seq id no：85～87任意一种所示的基序编码序列。

33、一些实施方案中，所述核酸分子为dna，所述核酸分子的序列包括：

34、1)、如seq dno：93-seq id no：130所示的至少一种核苷酸序列、seq id no：131-seq id no：133所示的至少一种核苷酸序列和如seq id no：134-seq id no：138所示的至少一种核苷酸序列；

35、2)、与1)所示的核苷酸序列编码相同的蛋白，但因遗传密码的简并性而与1)的核苷酸序列不同的核苷酸序列；

36、3)编码与1)或2)所示的核苷酸序列编码的蛋白具有75％以上同一性的蛋白变体的核苷酸序列。

37、本发明所述核酸分子还包括编码自剪切序列的核酸片段。一些实施方案中，所述自剪切序列包括p2a、t2a、e2a或f2a中至少一种。编码自剪切序列p2a、t2a、e2a和f2a的mrna序列依次如seq id no：143～146所示，dna序列依次如seq id no：147～150所示。

38、一些实施方案中，本发明核酸分子为mrma，其中的部分rna多核苷酸还可进行一些修饰，如5′末端帽、3′末端尾巴、化学修饰中的至少一种。一些实施方案中，核酸分子还包括至少一个5′末端帽、至少一个3′末端尾巴和/或至少一个化学修饰。其中，所述5’末端帽包括但不仅限于以下种类：7mg(5′)ppp(5′)nlmpnp、m7g(5′)ppp(5′)g、g(5′)ppp(5′)a、g(5′)ppp(5′)g、m7g(5′)ppp(5′)a、m7g(5′)ppp(5′)g或m7g(5’)pppn1mpn2mp。3′末端尾巴为为多聚腺苷酸尾巴，长度为20～300bp即长度在20～300个a之间的任意一种。化学修饰包括但不仅限于以下：假尿苷、n1-甲基假尿苷、n1-乙基假尿苷、2-硫代尿苷、4’-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲氧基尿苷和2’-o-甲基尿苷。

39、一些实施方案中，本发明所述核酸分子包括至少一个经以上化学修饰的核苷酸。

40、本发明还提供了所述的重组抗原蛋白、所述的核酸分子在制备流感疫苗中的应用。

41、本发明还提供一种核酸流感疫苗，包括本发明所述的核酸分子的至少一种。

42、本发明提供的抗流感病毒核酸疫苗还包括脂质纳米粒子，所述脂质纳米粒子中配制本发明所述的至少一种核酸分子。所述脂质纳米粒子由包括阳离子脂质、经peg修饰的脂质、固醇和非阳离子脂质的物质制成。本发明中，通过微流控设备，制备成脂纳米颗粒(lnp)-mrna。

43、本发明还提供一种抗流感病毒的方法，向受试者施用本发明所述的抗流感病毒核酸疫苗。

44、通过皮内注射、肌内注射、鼻内施用或者基因枪给药的方式向受试者施用所述抗流感病毒核酸疫苗。

45、本发明提供的核酸分子制成的核酸疫苗对流感病毒多种亚型具有较高的免疫原性，能够诱导机体产生的高滴度的中和抗体，对a型、b型流感病毒的多种亚型流感病毒株均具有很强的病毒中和活性，具有高效价和广谱性；同时攻毒试验表明，本发明提供的核酸疫苗对机体具有良好的免疫保护作用，能够抵抗多种流感病毒的侵染，具有良好的应用前景。