一种基于双色荧光标记的肿瘤细胞焦亡模型的构建方法

本发明涉及生物光学分子成像的，尤其涉及一种基于双色荧光标记的肿瘤细胞焦亡模型的构建方法。

背景技术：

1、细胞焦亡，作为一种促炎性的程序性细胞死亡方式，其发生时表现出典型的细胞“吐大泡”形态，细胞膜快速裂解，释放出大量细胞内免疫原性物质。gasdermin(gsdm)家族蛋白是诱导细胞焦亡发生的关键效应分子，gsdme蛋白是其中的成员之一。gsdme蛋白的表达水平决定细胞凋亡还是走向焦亡，肿瘤细胞表达高gsdme蛋白，可通过颗粒酶b、caspase-3切割活化gsdme蛋白，产生n端-gsmde的聚集体，在细胞膜上打孔，诱导肿瘤细胞焦亡，重编程肿瘤微环境的免疫状态，激起机体的抗肿瘤免疫反应。

2、化疗是最常见的癌症治疗形式，细胞焦亡被认为是提高化疗药物抗肿瘤效果的有效手段，化疗药物通过引发肿瘤细胞焦亡来激起机体的抗肿瘤免疫反应。基于此，通过操纵肿瘤细胞焦亡来进行肿瘤治疗具有巨大的潜力。由于肿瘤细胞焦亡的发生后，产生的免疫学预后等均不同于凋亡、坏死等其他细胞死亡方式。因此，构建一种肿瘤细胞焦亡模型，有利于探究肿瘤细胞焦亡激起的免疫学分子机制。

3、现有相关文献报道，肿瘤细胞焦亡株可以通过慢病毒转染的方式来获取稳定表达gsdme的肿瘤细胞焦亡细胞株，使用病毒载体操作步骤繁琐，实验环境要求严格，成本昂贵。此外，使用上述方式获取的肿瘤细胞焦亡株，缺乏适用于可视化成像的分子标记，无法可视化细胞焦亡过程中细胞核的和细胞质的动态变化信息。

技术实现思路

1、本发明提供了一种基于双色荧光标记的肿瘤细胞焦亡模型的构建方法，以至少解决现有技术中存在的无法可视化细胞焦亡过程中细胞核的和细胞质的动态变化信息的技术问题。

2、本发明提供了一种基于双色荧光标记的肿瘤细胞焦亡模型的构建方法，所述方法包括：

3、构建双色荧光蛋白标记细胞焦亡效应基因gsdme和组蛋白基因h2b的pb载体质粒；

4、筛选稳定表达双色荧光蛋白标记的gsdme和h2b的b16肿瘤细胞焦亡细胞株；

5、使用caspase-3活化的药物刺激双色荧光蛋白标记的gsdme和h2b的b16肿瘤细胞焦亡细胞株，通过荧光显微成像可视化b16肿瘤细胞焦亡过程以及细胞活性检测。

6、在一可实施方式中，所述双色荧光蛋白为mcerulean和mcherry。

7、在一可实施方式中，所述构建双色荧光蛋白标记细胞焦亡效应基因gsdme和组蛋白基因h2b的pb载体质粒，包括：

8、使用限制性内切酶切开pb载体，使pb载体线性化；

9、用mcerulean标记gsdme片段，获得gsdme-mcerulean片段；使用mcherry标记h2b片段，获得h2b-mcherry片段；

10、将所述gsdme-mcerulean片段和所述h2b-mcherry片段构建到pb载体上，获取双色荧光蛋白标记gsdme-mcerulean和h2b-mcherry的pb载体质粒。

11、在一可实施方式中，所述gsdme-mcerulean片段和所述h2b-mcherry片段通过ires-linker连接起来，以使两个荧光蛋白标记的分子能够独立表达；

12、所述ires的碱基序列为：

13、ctcgagtactccggtattgcggtacccttgtacgcctgttttatactcccttcccgtaacttagacgcacaaaaccaagttcaatagaagggggtacaaaccagtaccaccacgaacaagcacttctgtttccccggtgatgtcgtatagactgcttgcgtggttgaaagcgacggatccgttatccgcttatgtacttcgagaagcccagtaccacctcggaatcttcgatgcgttgcgctcagcactcaaccccagagtgtagcttaggctgatgagtctggacatccctcaccggtgacggtggtccaggctgcgttggcggcctacctatggctaacgccatgggacgctagttgtgaacaaggtgtgaagagcctattgagctacataagaatcctccggcccctgaatgcggctaatcccaacctcggagcaggtggtcacaaaccagtgattggcctgtcgtaacgcgcaagtccgtggcggaaccgactactttgggtgtccgtgtttccttttattttattgtggctgcttatggtgacaatcacagattgttatcataaagcgaattggataggatccgtacgatggtggtagggatccg。

14、在一可实施方式中，所述筛选稳定表达双色荧光蛋白标记的gsdme和h2b的b16肿瘤细胞焦亡细胞株，包括：

15、将包含gsdme-mcerulean和h2b-mcherry的pb载体质粒和表达pbase转座酶的辅助质粒共转染到敲除了gsdme基因的b16肿瘤细胞中；

16、培养转染后的肿瘤细胞，定点消化筛选出稳定表达双色荧光蛋白的b16肿瘤细胞焦亡的单克隆细胞株。

17、在一可实施方式中，所述转染后的肿瘤细胞置于含10％胎牛血清的rpmi1640培养基中，在37℃含5％ co2条件下培养。

18、在一可实施方式中，所述定点消化筛选出稳定表达双色荧光蛋白的b16肿瘤细胞焦亡的单克隆细胞株，包括：

19、对转染后的b16肿瘤细胞进行消化，将消化后的细胞铺到96孔板中，培养多天后，荧光显微镜下筛选出表达双色荧光蛋白的单克隆细胞团，并将所述单克隆细胞团吸取到新的孔板中培养；

20、培养多天后，荧光显微镜下筛选具有双色荧光的单克隆细胞团，每个孔只有一个有双色荧光团的细胞。

21、在一可实施方式中，筛选的稳定表达双色荧光蛋白标记gsdme-mcerulean和h2b-mcherry的b16焦亡细胞株的发光率在95％以上。

22、在一可实施方式中，所述使用caspase-3活化的药物刺激双色荧光标记的b16肿瘤细胞焦亡细胞株，荧光显微成像可视化b16肿瘤细胞焦亡以及细胞活性检测，包括：

23、caspase-3活化的raptinal药物刺激筛选的双色荧光标记的b16肿瘤细胞焦亡细胞株，长时程动态成像观察b16肿瘤细胞焦亡的全过程；

24、caspase-3活化的raptinal药物刺激b16肿瘤细胞焦亡细胞株，收集药物刺激后不同时间点的细胞培养物上清，检测细胞乳酸脱氢酶ldh的释放，定量分析细胞活性。

25、本发明公开了一种基于双色荧光标记的肿瘤细胞焦亡模型的构建方法，通过构建双色荧光蛋白标记gsdme和h2b的pb载体质粒；再筛选稳定表达双色荧光蛋白标记的gsdme和h2b的b16肿瘤细胞焦亡细胞株；然后使用caspase-3活化的药物刺激双色荧光蛋白标记的gsdme和h2b的b16肿瘤细胞焦亡细胞株，通过荧光显微成像可视化b16肿瘤细胞焦亡过程以及细胞活性检测。本发明一方面能够直观可视化观察肿瘤细胞焦亡发生时细胞核以及细胞形态学的变化；另一方面本发明建立的b16肿瘤细胞焦亡细胞株模型可作为筛选诱导细胞焦亡药物的有力工具，为进一步探究可视化细胞焦亡激起的免疫学分子机制提供手段。

26、应当理解，本部分所描述的内容并非旨在标识本发明的实施例的关键或重要特征，也不用于限制本发明的范围。本发明的其它特征将通过以下的说明书而变得容易理解。