一种关节修复蛋白组合物及其制备方法和其应用与流程

本发明属于生物医药，具体涉及一种具有关节修复蛋白组合物及其制备方法和其应用。

背景技术：

1、老年人关节损伤及退行性病变或软骨损伤等问题呈现逐年递增。关节损伤(如关节外伤性病变、退变性骨关节病变等)为临床常见病症，包括难愈性创面病变、膝关节骨性关节病变、膝关节软骨磨损、软骨损伤等。

2、关节损伤及关节软骨损伤的治疗或修复方式包括消炎、镇痛(止痛)、理疗、针灸、关节置换、干细胞治疗、射频消融、软骨细胞移植、骨软骨移植、工程软骨，如以中医理疗和氨糖为代表的的物理治疗和营养、以几丁糖和透明质酸为代表的润滑缓解、以prp为代表的抗炎治疗、以及关节镜和人工关节为代表的关节置换等，除关节置换外，均以缓解症状和延缓病程为主，缺乏真正有效且安全的治疗方式。

3、关节软骨没有血管、神经、淋巴系统分布，含有的软骨细胞量少、迁移与增殖能力有限，关节软骨损伤难以自愈。当关节软骨的血液供应和神经支配出现故障时易导致关节损伤，进而影响关节修复能力。如不进行及时的有效治疗和修复损伤，则损伤将继续加重并引发骨关节性病变，导致关节疼痛、关节肿胀或运动障碍，甚至由此导致不可逆的病理变化及关节退行性改变，影响患者的行动和致残。关节损伤修复是一个长期、渐进的缓慢过程。及时修复损伤细胞可以显著改善、治疗相关病变。

4、细胞及微生物受到外界刺激及外源应激物(包括冷、热、酸、碱、电流、辐射、化学物质等)应激诱导时会因应激反应而诱导细胞及微生物产生应激蛋白。文献1(newlimonophyllines a-c from the stem of atalantia monophylla and cytotoxicityagainst cholangiocarcinoma and hepg2 cell lines，arch.pharm.res.(2018)41:431–437)公开了从芸香科植物(atalantia monophylla)提取制得的化合物1-16具有抑制肿瘤细胞生长等活性。

5、间充质干细胞(mesenchymal stem cells，mscs)具有自我复制和多向分化潜能，广泛存在于骨髓、脂肪、滑膜、牙髓、羊水、胎盘、脐带、胚胎、脐带血、羊膜、外周血、肌肉、尿液等组织，具有来源广泛、无需配型、感染率低、分化潜能强、增殖能力强、采集方便等特点，可产生干细胞生长因子(scf)、神经生长因子(ngf)、白介素-6(il-6)、白介素-7(il-7)、肿瘤坏死因子(tnf)、干扰素(ifn)等活性因子，参与调节细胞生长、细胞凋亡、细胞分化、抗病毒、免疫成熟等过程，可用于免疫调节、组织修复及治疗急性肺损伤、重症肺炎、急性呼吸窘迫综合征等疾病。但mscs产品需在其生产、储运和应用等环节采用冷藏方式，且其细胞活力保持≤12h，而限制其治疗应用。为此，需要开发安全有效的关节修复药物以满足临床需求。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种关节修复蛋白组合物，其制备包括下述步骤：

2、(1)在本发明的细胞蛋白提取物中加入20u/ml-35u/ml的核酸酶或全能核酸酶的任一种或其组合，将其置于37℃±1℃条件下酶解15min-40min，制得酶解液，将其置于2℃-4℃条件下备用；

3、(2)在2℃-8℃条件下，将步骤(1)制得的酶解液用洗脱溶剂配置成5-15mg/ml后，过色谱柱，洗脱流速为0.1-1ml/min，监测并收集紫外波长为280nm的洗脱部位，即得，其中，洗脱溶剂由50mmol/l磷酸盐缓冲液(ph6.8)中含300mmol/l氯化钠组成。

4、本发明优选的技术方案中，所述细胞蛋白提取物的制备包括如下步骤：

5、s-1:将密度为5.0×106个/ml-1.0×107个/ml的间充质传代细胞置于含有dmem/f12 40-50％、rpmi1640 40-50％、牛血清蛋白(bsa)0.1-2％、表皮细胞生长因子(egf)1-15ug/ml、成纤维细胞生长因子(fgf)1-15ug/ml、胰岛素转铁蛋白1-15ug/ml、复方氨基酸(18aa)0.01-0.1％和2-10μmol/l应激物的培养基中，再将其置于37.0℃±0.5℃、5％±1.0％co2条件下培养10h-14h后，分离，洗涤，收集细胞，其中，所述的应激物选自化合物1-16的任一种或其组合，

6、

7、

8、s-2:将收集细胞按照密度为5.0×106个/ml-1.0×107个/ml分散于溶剂中，再将其置于2℃-8℃下超声处理，制得细胞裂解液，其中，所述溶剂选自选自生理盐水、5％葡萄糖溶液、磷酸盐缓冲液(pbs)、tbps缓冲液、tbst缓冲液、tris缓冲液的任一种或其组合；

9、s-3:将步骤s-2制得的细胞裂解液分离后，所得的分离液依次经0.45um、0.22um滤膜过滤，即得。

10、本发明的优选技术方案中，步骤s-1的培养基中含有dmem/f1242-45％、rpmi164042-45％、牛血清蛋白(bsa)0.5-1.5％、表皮细胞生长因子(egf)5-10ug/ml、成纤维细胞生长因子(fgf)5-10ug/ml、胰岛素转铁蛋白5-10ug/ml、复方氨基酸(18aa)0.02-0.05％和3-8μmol/l的应激物。

11、本发明的优选技术方案中，步骤s-1的培养基中含有dmem/f1245％、rpmi164045％、牛血清蛋白(bsa)0.5％、表皮细胞生长因子(egf)10ug/ml、成纤维细胞生长因子(fgf)10ug/ml，胰岛素转铁蛋白10ug/ml、复方氨基酸(18aa)0.05％和4-6μmol/l的应激物。

12、本发明的优选技术方案中，步骤s-1的间充质传代细胞密度为6.0×106-2.0×107个/ml，优选为8.0×106-1.0×107个/ml。

13、本发明的优选技术方案中，步骤s-1的间充质传代干细胞在培养基中培养11h-13h。

14、本发明的优选技术方案中，步骤s-1中洗涤细胞的溶剂选自生理盐水、5％葡萄糖溶液、磷酸盐缓冲液(pbs)、tbps缓冲液、tbst缓冲液、tris缓冲液的任一种或其组合,洗涤细胞次数为2-5次，优选为3-4次。

15、本发明的优选技术方案中，步骤s-1所述的分离选自离心、过滤的任一种或其组合，其中，所述离心条件为1000-2000rpm*3-15min，优选为1200rpm-1500rpm*5-10min。

16、本发明的优选技术方案中，步骤s-2的超声条件为：在2℃-8℃、25khz、360w条件下工作3s再间隙1s，超声处理1-5min。

17、本发明的优选技术方案中，步骤s-3所述分离选自2000-8000rpm*10-30min离心、多级离心、多级过滤的任一种或其组合，优选为3000-7000rpm*15-25min。

18、本发明的优选技术方案中，步骤s-3的多级离心依次为3000-4000rpm*3-5min、5000-6000rpm*3-5min和7000rpm*5-8min。

19、本发明的优选技术方案中，所述多级过滤的滤膜孔径选自80um、50um、30um、10um、5um的任一种。

20、本发明的优选技术方案中，将步骤s-3制得的细胞蛋白提取物或步骤(2)制得的蛋白组合物冻存，优选冻存于-40℃至-20℃。

21、本发明的优选技术方案中，在步骤s-3制得的细胞蛋白提取物或步骤(2)制得的蛋白组合物中加入冻干保护剂，冻干，制得细胞蛋白提取物冻干制剂或蛋白组合物冻干制剂，其中，所述冻干保护剂选自甘露醇、山梨糖醇、右旋糖酐、甘油、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、葡聚糖、三辛酸甘油酯(hes)、聚乙二醇、乙烯乙二烯、磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、山梨醇、淀粉中的任一种或其组合。

22、本发明的优选技术方案中，以质量百分比计，所述冻干制剂中含有冻干保护剂0.5-8％，优选为1-5％。

23、本发明的优选技术方案中，在步骤s-3制得的细胞蛋白提取物或步骤(2)制得的蛋白组合物中任选地加入蛋白稳定剂，其中，所述蛋白稳定剂选自白蛋白、锌盐、铝盐的任一种。

24、本发明的优选技术方案，所述细胞蛋白提取物冻干制剂或蛋白组合物冻干制剂ph6-8，优选为ph7-7.5。

25、本发明的优选技术方案中，将步骤s-3制得的细胞蛋白提取物采用核酸酶或全能核酸酶的任一种酶解后再分离纯化。

26、本发明的优选技术方案中，所述核酸酶选自rna核酸酶、dna核酸酶的任一种或其组合。

27、本发明的优选技术方案中，在本发明制得的细胞蛋白提取物中加入25u/ml-30u/ml的核酸酶或全能核酸酶的任一种或其组合，将其置于37℃±1℃条件下酶解20min-30min，制得酶解液。

28、本发明的优选技术方案中，所述关节修复蛋白组合物的分子量为25kda-245kda，优选为50kda-200kda。

29、本发明的优选技术方案，所述关节修复蛋白组合物中的蛋白组成如图2所示。

30、本发明的优选技术方案中，所述冻干制剂临用前用等渗溶液复溶后，采用涂抹、滚针、微针、按摩、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、穴位注射、腰椎穿刺的任一种或其组合方式使用，其中，所述的等渗溶液选自生理盐水、5％葡萄糖溶液、磷酸盐缓冲液(pbs)、tbps缓冲液、tbst缓冲液、tris缓冲液的任一种或其组合。

31、本发明的间充质传代干细胞的培养或原代间充质干细胞的培养采用本领域的培养方法。

32、本发明的优选技术方案中，所述间充质传代干细胞的培养包括下述步骤：将原代间充质干细胞按照初始密度为5.0×105-5.0×106个/ml加入到传代培养基中，再将其置于37.0℃±0.5℃、5％±1.0％co2条件下培养10-15天，每隔2-3天，观察传代培养基变黄后，半量更换传代培养基，其中，所述传代培养基含有10％fbs、100u/ml青霉素和100ug/ml链霉素的dmem/f12培养基。

33、本发明的优选技术方案中，所述原代间充质干细胞的培养包括下述步骤：

34、a:将脐带清洗消毒后，组织解剖，取华通胶层组织，将其切成3mm3的小块，离心，清洗，收集组织块，将其置于含10％胎牛血清fbs、100ug/ml青霉素、100ug/ml链霉素的dmem/f12培养基中，再将其置于37.0℃±0.5℃、5％±1.0％co2条件下培养，每间隔2-3天半量更换培养基，培养至组织块爬出细胞；

35、b:振摇，收集低层细胞用pbs清洗后，加入0.25％的胰蛋白酶消化2min-3min，加入等体积的胰蛋白酶终止液停止消化，吸管轻轻吹打，1200-1500rpm/min*5-8min离心后，收集细胞，即得。

36、本发明的目的在于提供一种具有关节修复功效的细胞蛋白提取物的制备方法，包括如下步骤：

37、s-1:将密度为5.0×106个/ml-1.0×107个/ml的间充质传代细胞置于含有dmem/f12 40-50％、rpmi1640 40-50％、牛血清蛋白(bsa)0.1-2％、表皮细胞生长因子(egf)1-15ug/ml、成纤维细胞生长因子(fgf)1-15ug/ml、胰岛素转铁蛋白1-15ug/ml、复方氨基酸(18aa)0.01-0.1％和2-10μmol/l应激物的培养基中，再将其置于37.0℃±0.5℃、5％±1.0％co2条件下培养10h-14h后，分离，洗涤，收集细胞，其中，所述的应激物选自化合物1-16的任一种或其组合；

38、s-2:将收集细胞按照密度为5.0×106个/ml-1.0×107个/ml分散于溶剂中，再将其置于2℃-8℃下超声处理，制得细胞裂解液，其中，所述溶剂选自选自生理盐水、5％葡萄糖溶液、磷酸盐缓冲液(pbs)、tbps缓冲液、tbst缓冲液、tris缓冲液的任一种或其组合；

39、s-3:将步骤s-2制得的细胞裂解液分离后，所得的分离液依次经0.45um、0.22um滤膜过滤，即得。

40、本发明的优选技术方案中，步骤s-1的培养基中含有dmem/f1242-45％、rpmi164042-45％、牛血清蛋白(bsa)0.5-1.5％、表皮细胞生长因子(egf)5-10ug/ml、成纤维细胞生长因子(fgf)5-10ug/ml、胰岛素转铁蛋白5-10ug/ml、复方氨基酸(18aa)0.02-0.05％和3-8μmol/l的应激物。

41、本发明的优选技术方案中，步骤s-1的培养基中含有dmem/f1245％、rpmi164045％、牛血清蛋白(bsa)0.5％、表皮细胞生长因子(egf)10ug/ml、成纤维细胞生长因子(fgf)10ug/ml，胰岛素转铁蛋白10ug/ml、复方氨基酸(18aa)0.05％和4-6μmol/l的应激物。

42、本发明的优选技术方案中，步骤s-1的间充质传代细胞密度为5.0×106-2.0×107个/ml，优选为8.0×106-1.0×107个/ml。

43、本发明的优选技术方案中，步骤s-1的间充质传代干细胞在培养基中培养11h-13h。

44、本发明的优选技术方案中，步骤s-1中洗涤细胞的溶剂选自生理盐水、5％葡萄糖溶液、磷酸盐缓冲液(pbs)、tbps缓冲液、tbst缓冲液、tris缓冲液的任一种或其组合,洗涤细胞次数为2-5次，优选为3-4次。

45、本发明的优选技术方案中，步骤s-1所述的分离选自离心、过滤的任一种或其组合，其中，所述离心条件为1000-2000rpm*3-15min，优选为1200rpm-1500rpm*5-10min。

46、本发明的优选技术方案中，步骤s-2的超声条件为：在2℃-8℃、25khz、360w条件下工作3s再间隙1s，超声处理1-5min。

47、本发明的优选技术方案中，步骤s-3所述分离选自2000-8000rpm*10-30min离心、多级离心、多级过滤的任一种或其组合，优选为3000-7000rpm*15-25min。

48、本发明的优选技术方案中，步骤s-3的多级离心依次为3000-4000rpm*3-5min、5000-6000rpm*3-5min和7000rpm*5-8min。

49、本发明的优选技术方案中，所述多级过滤的滤膜孔径选自80um、50um、30um、10um、5um的任一种。

50、本发明的优选技术方案中，将步骤s-3制得的细胞蛋白提取物冻存，优选冻存于-40℃至-20℃。

51、本发明的优选技术方案中，将步骤s-3制得的细胞蛋白提取物采用核酸酶或全能核酸酶的任一种酶解后再分离纯化。

52、本发明的间充质传代干细胞的培养或原代间充质干细胞的培养采用本领域的培养方法。

53、本发明的优选技术方案中，所述间充质传代干细胞的培养包括下述步骤：将原代间充质干细胞按照初始密度为5.0×105-5.0×106个/ml加入到传代培养基中，再将其置于37.0℃±0.5℃、5％±1.0％co2条件下培养10-15天，每隔2-3天，观察传代培养基变黄后，半量更换传代培养基，其中，所述传代培养基含有10％fbs、100u/ml青霉素和100ug/ml链霉素的dmem/f12培养基。

54、本发明的优选技术方案中，所述原代间充质干细胞的培养包括下述步骤：

55、a:将脐带清洗消毒后，组织解剖，取华通胶层组织，将其切成3mm3的小块，离心，清洗，收集组织块，将其置于含10％胎牛血清fbs、100ug/ml青霉素、100ug/ml链霉素的dmem/f12培养基中，再将其置于37.0℃±0.5℃、5％±1.0％co2条件下培养，每间隔2-3天半量更换培养基，培养至组织块爬出细胞；

56、b:振摇，收集低层细胞用pbs清洗后，加入0.25％的胰蛋白酶消化2min-3min，加入等体积的胰蛋白酶终止液停止消化，吸管轻轻吹打，1200-1500rpm/min*5-8min离心后，收集细胞，即得。

57、本发明的另一目的在于提供一种关节修复蛋白组合物的制备方法，包括如下步骤：

58、(1)在本发明的细胞蛋白提取物中加入20u/ml-35u/ml的核酸酶或全能核酸酶的任一种或其组合，将其置于37℃±1℃条件下酶解15min-40min，制得酶解液，将其置于2℃-4℃条件下备用；

59、(2)在2℃-8℃条件下，将步骤(1)制得的酶解液用洗脱溶剂配置成5-15mg/ml后，过色谱柱，洗脱流速为0.1-1ml/min，监测并收集紫外波长为280nm的洗脱部位，即得，其中，洗脱溶剂由50mmol/l磷酸盐缓冲液(ph6.8)中含300mmol/l氯化钠组成。

60、本发明的优选技术方案中，所述核酸酶选自rna核酸酶、dna核酸酶的任一种或其组合。

61、本发明的优选技术方案中，在本发明制得的细胞蛋白提取物中加入25u/ml-30u/ml的核酸酶或全能核酸酶的任一种或其组合，将其置于37℃±1℃条件下酶解20min-30min，制得酶解液。

62、本发明的优选技术方案中，所述关节修复蛋白组合物的分子量为25kda-245kda，优选为50kda-200kda。

63、本发明的优选技术方案中，将步骤(2)制得的蛋白组合物冻存，优选冻存于-40℃至-20℃。

64、本发明的优选技术方案中，在步骤(2)制得的蛋白组合物中加入冻干保护剂，冻干，即得，其中，所述冻干保护剂选自甘露醇、山梨糖醇、右旋糖酐、甘油、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、葡聚糖、三辛酸甘油酯(hes)、聚乙二醇、乙烯乙二烯、磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、山梨醇、淀粉中的任一种或其组合。

65、本发明的优选技术方案中，以质量百分比计，所述冻干制剂中含有冻干保护剂0.5-8％，优选为1-5％。

66、本发明的优选技术方案中，将步骤(2)制得的蛋白组合物中任选地加入蛋白稳定剂，其中，所述蛋白稳定剂选自白蛋白、锌盐、铝盐的任一种。

67、本发明的优选技术方案，所述蛋白组合物冻干制剂ph6-8，优选为ph7-7.5。

68、本发明的优选技术方案，所述关节修复蛋白组合物中的蛋白组成如图2所示。

69、本发明的优选技术方案中，所述冻干制剂临用前用等渗溶液复溶后，采用涂抹、滚针、微针、按摩、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、穴位注射、腰椎穿刺的任一种或其组合方式使用，其中，所述的等渗溶液选自生理盐水、5％葡萄糖溶液、磷酸盐缓冲液(pbs)、tbps缓冲液、tbst缓冲液、tris缓冲液的任一种或其组合。

70、本发明的另一目的在于提供一种关节修复组合物，所述组合物由本发明的具有关节修复功效的细胞蛋白提取物或关节修复蛋白组合物的任一种或其组合和药学上可接受的载体组成。

71、本发明的药学上可接受载体的用量或其种类根据组合物中有效成分的理化性质和含量、制剂类型、制剂的溶出及生物利用度等因素而定。

72、本发明的组合物可为本领域的剂型，并可采用本领域的制剂技术制备得到。

73、本发明的优选技术方案中，所述组合物选自冻干剂、凝胶剂、鼻喷剂、液体敷料、注射剂、贴剂、膏剂、霜剂、乳剂、栓剂的任一种。

74、本发明的优选技术方案中，所述组合物的给药方式选自涂抹、滚针、微针、按摩、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、穴位注射、腰椎穿刺的任一种或其组合。

75、本发明的另一目的在于提供本发明所述具有关节修复功效的细胞蛋白提取物、关节修复蛋白组合物或其组合物用于制备细胞修复、关节修复、软骨修复的制品中的应用。

76、本发明的优选技术方案中，所述关节修复或软骨修复选自关节外伤性病变、退变性骨关节病变、关节损伤、难愈性创面病变、膝关节骨性关节病变、软骨损伤的任一种或其并发症。

77、本发明的优选技术方案中，所述制品用于骨关节养护人群、中老年骨退行性疾病人群、运动损伤人群、运动保养人群、骨关节疾病术后康复人群的任一种或其组合。

78、本发明的另一目的在于提供化合物1-16用于应激诱导干细胞产生具有修复功效的功能蛋白的应用。

79、本发明的优选技术方案中，所述修复为细胞修复、毛囊修复、关节修复、修复中的任一种。

80、除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。

81、除非另有说明，本发明间充质干细胞mscs鉴定参照《standards for the cultureand quality control of umbilical cord mesenchymal stromal cells forneurorestorative clinical application》。

82、与现有技术相比，本发明具有下述有益效果：

83、1、本发明科学筛选含有应激物的培养基应激诱导间充质干细胞产生具有细胞修复功效的细胞蛋白，所得的细胞蛋白提取物、细胞蛋白组合物或其组合物具有细胞修复、关节修复、软骨修复的效果，激活创面软骨细胞再生，促进损伤修复，用于防治关节外伤性病变、退变性骨关节病变、关节损伤、难愈性创面病变、膝关节骨性关节病变、软骨损伤的任一种或其并发症，并具有纯度高、稳定性好、安全有效、便于储运等优点。

84、2、本发明的制备方法具有操作简便，绿色环保，成本更优，适用于工业化生产等优点。