一种神经修复蛋白组合物及其制备方法和其应用与流程

本发明属于生物医药，具体涉及一种神经修复蛋白组合物及其制备方法和其应用。

背景技术：

1、细胞是生命活动的基本单位和机体健康的基础。当机体的氧化还原平衡遭到破坏时，会引起氧化还原信号和控制的中断，引发氧化应激损伤而引发多种疾病。脑部缺血缺氧(如脑卒中、脑溢血、长期高原作业、颈内动脉及椎动脉闭塞和/或狭窄等)及氧化应激损伤等，可引发多种因神经元或胶质细胞的丢失而导致的神经退行性疾病，包括记忆力减退、阿尔兹海默症、帕金森症、老年痴呆、多发性硬化症、共济失调、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化症等。目前，我国帕金森患者超过300万，渐冻症患者超过20万，老年痴呆患者超过千万，且随着全球人口老年化的加剧而存在高发病率等特点。及时修复损伤细胞可以显著改善、治疗相关病变。

2、脑卒中(脑供血动脉狭窄或闭塞导致血液不能流入大脑)及脑溢血(脑部血管突然破裂)为常见的中枢神经系统疾病，因脑供血不足所致脑组织缺血缺氧性损伤，并表现出相应神经功能缺损症状，包括平衡问题、偏瘫、感觉和振动感觉丧失、麻木、反射减弱、上睑下垂、视野缺陷、失语和失用等，过量的自由基是早期急性缺血性卒中缺血再灌注损伤加重的主要原因，该病变具有发病率高、疾病预后差、易复发、致残率高、死亡率高等特点，严重影响人类的健康和生存质量。共济失调多由小脑、本体感觉及前庭功能障碍导致的运动笨拙和不协调，累及躯干、四肢和咽喉肌时可引起身体平衡、姿势、步态及言语障碍，包括小脑性共济失调、大脑性共济失调、感觉性共济失调、前庭性共济失调等，病因复杂且常为多种疾病的综合表现，包括由梗死、水肿或出血导致的急性脑肿胀等。脑外伤多由外物造成的头脑部外伤伤害，常引起不同程度的永久性功能障碍，包括运动、感觉、言语、视觉、听觉等区域异常局灶性症状。周围神经损伤主要由创伤、肿瘤及代谢性疾病(如糖尿病及其并发症)等因素引起的临床常见病，经常会导致机体受累节段运动、感觉和自主功能的部分或全部丧失，甚至出现顽固性神经痛，严重影响患者的生活质量。who于2017年发布《全球糖尿病报告》显示，全球糖尿病患病人数呈现逐年增加趋势。我国糖尿病患者1.29亿，其多种并发症(包括周围神经及末梢神经缺血缺氧引起的神经痛、神经损伤等)导致糖尿病患者致残致死等严重后果。

3、脑卒中的临床治疗在溶栓的同时强调脑神经保护，以期逆转神经元凋亡并改善神经损伤。丁苯酞可降低细胞内钙离子浓度，抑制谷氨酸释放并减少花生四烯酸生成、清除氧自由基、提高氧化酶活性等，作用于脑缺血病变的多个病理环节，临床将其用于改善脑梗死病灶局部循环，减小梗死面积，减轻脑组织损伤，恢复神经功能，用于急性脑缺血性脑卒中患者神经功能缺损的改善，主要用于治疗轻、中度急性缺血性脑卒中。依达拉奉右莰醇为抗氧化剂和自由基清除剂，可清除多种自由基，减轻脑水肿和组织损伤，抑制脑缺血再灌注导致的炎性因子表达而减少细胞凋亡和细胞坏死，临床将其用于改善急性脑梗塞所致的神经症状、日常生活活动能力和功能障碍等。

4、细胞及微生物受到外界刺激及外源应激物(包括冷、热、酸、碱、电流、辐射、化学物质等)应激诱导时会因应激反应而诱导细胞及微生物产生应激蛋白。文献1(newlimonophyllines a-c from the stem of atalantia monophylla and cytotoxicityagainst cholangiocarcinoma and hepg2 cell lines，arch.pharm.res.(2018)41:431–437)公开了从芸香科植物(atalantia monophylla)提取制得的化合物1-16具有抑制肿瘤细胞生长等活性。

5、间充质干细胞(mesenchymal stem cells，mscs)具有自我复制和多向分化潜能，广泛存在于骨髓、脂肪、滑膜、牙髓、羊水、胎盘、脐带、胚胎、脐带血、羊膜、外周血、肌肉、尿液等组织，具有来源广泛、无需配型、感染率低、分化潜能强、增殖能力强、采集方便等特点，可产生干细胞生长因子(scf)、神经生长因子(ngf)、白介素-6(il-6)、白介素-7(il-7)、肿瘤坏死因子(tnf)、干扰素(ifn)等活性因子，参与调节细胞生长、细胞凋亡、细胞分化、抗病毒、免疫成熟等过程，可用于免疫调节、组织修复及治疗急性肺损伤、重症肺炎、急性呼吸窘迫综合征等疾病。但mscs产品需在其生产、储运和应用等环节采用冷藏方式，且其细胞活力保持≤12h，而限制其治疗应用。为此，需要开发安全有效的神经修复药物以满足临床需求。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种神经修复蛋白组合物，其制备包括下述步骤：

2、(1)在本发明的细胞蛋白提取物中加入20u/ml-35u/ml的核酸酶或全能核酸酶的任一种或其组合，将其置于37℃±1℃条件下酶解15min-40min，制得酶解液；

3、(2)在2℃-8℃条件下，将步骤(1)制得的酶解液用洗脱溶剂配置成5-15mg/ml后，过色谱柱，洗脱流速为0.1-1ml/min，监测并收集紫外波长为280nm的洗脱馏分，即得，其中，洗脱溶剂由50mmol/l磷酸盐缓冲液(ph6.8)中含300mmol/l氯化钠组成。

4、本发明的优选技术方案中，所述蛋白提取物的制备包括如下步骤：

5、s-1:将密度为5.0×106个/ml-1.0×107个/ml的间充质传代干细胞置于含有dmem/f12 40-50％、rpmi1640 40-50％、牛血清蛋白(bsa)0.1-2％、表皮细胞生长因子(egf)1-15ug/ml、成纤维细胞生长因子(fgf)1-15ug/ml、胰岛素转铁蛋白1-15ug/ml、复方氨基酸(18aa)0.01-0.1％和2-10μmol/l应激物的培养基中，再将其置于37.0℃±0.5℃、5％±1.0％co2条件下培养2h-6h后，分离，洗涤，收集细胞，其中，所述的应激物选自化合物1-16的任一种或其组合，

6、

7、

8、s-2:将收集细胞按照密度为5.0×106个/ml-5.0×107个/ml分散于溶剂中，再将其置于2℃-8℃条件下超声处理，制得细胞裂解液，其中，所述溶剂选自选自生理盐水、5％葡萄糖溶液、磷酸盐缓冲液(pbs)、tbps缓冲液、tbst缓冲液、tris缓冲液的任一种或其组合；

9、s-3:将步骤s-2制得的细胞裂解液分离后，所得的分离液依次经0.45um、0.22um滤膜过滤，即得。

10、本发明的优选技术方案中，步骤s-1的培养基中含有dmem/f1242-45％、rpmi164042-45％、牛血清蛋白(bsa)0.5-1.5％、表皮细胞生长因子(egf)5-10ug/ml、成纤维细胞生长因子(fgf)5-10ug/ml、胰岛素转铁蛋白5-10ug/ml、复方氨基酸(18aa)0.02-0.05％和3-8μmol/l的应激物。

11、本发明的优选技术方案中，步骤s-1的培养基中含有dmem/f1245％、rpmi164045％、牛血清蛋白(bsa)0.5％、表皮细胞生长因子(egf)10ug/ml、成纤维细胞生长因子(fgf)10ug/ml，胰岛素转铁蛋白10ug/ml、复方氨基酸(18aa)0.05％和4-6μmol/l的应激物。

12、本发明的优选技术方案中，步骤s-1的间充质传代干细胞密度为8.0×106-2.0×107个/ml，优选为8.0×106-1.0×107个/ml。

13、本发明的优选技术方案中，步骤s-1的间充质传代干细胞在培养基中培养3h-5h，优选为3.5h-4.5h。

14、本发明的优选技术方案中，步骤s-1中洗涤细胞的溶剂选自生理盐水、5％葡萄糖溶液、磷酸盐缓冲液(pbs)、tbps缓冲液、tbst缓冲液、tris缓冲液的任一种或其组合,细胞洗涤次数为2-5次，优选为3-4次。

15、本发明的优选技术方案中，步骤s-1所述的分离选自离心、过滤的任一种或其组合，其中，所述离心条件为1000-2000rpm*3-15min，优选为1200rpm-1500rpm*5-10min。

16、本发明的优选技术方案中，步骤s-2的超声条件为：在2℃-8℃、25khz、360w条件下工作3s再间隙1s，超声处理1-5min。

17、本发明的优选技术方案中，步骤s-3所述的分离选自2000-8000rpm*10-30min离心、多级离心、多级过滤的任一种或其组合，优选为3000-7000rpm*15-25min。

18、本发明的优选技术方案中，步骤s-3的多级离心依次为3000-4000rpm*3-5min、5000-6000rpm*3-5min和7000rpm*5-8min。

19、本发明的优选技术方案中，所述多级过滤的滤膜孔径选自80um、50um、30um、10um、5um的任一种。

20、本发明的优选技术方案中，在s-3制得的细胞蛋白提取物中加入25u/ml-30u/ml的核酸酶或全能核酸酶的任一种或其组合，将其置于37℃±1℃条件下酶解20min-30min，制得酶解液。

21、本发明的优选技术方案中，所述核酸酶选自rna核酸酶、dna核酸酶的任一种或其组合。

22、本发明的优选技术方案中，将步骤s-3制得的细胞蛋白提取物或步骤(2)制得的蛋白组合物冻存，优选冻存于-40℃至-20℃。

23、本发明的优选技术方案中，在步骤s-3制得的细胞蛋白提取物或步骤(2)制得的蛋白组合物中加入冻干保护剂，冻干，制得细胞蛋白提取物冻干制剂或蛋白组合物冻干制剂，其中，所述冻干保护剂选自甘露醇、山梨糖醇、右旋糖酐、甘油、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、葡聚糖、三辛酸甘油酯(hes)、聚乙二醇、乙烯乙二烯、磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、山梨醇、淀粉中的任一种或其组合。

24、本发明的优选技术方案中，以质量百分比计，所述冻干制剂中含有冻干保护剂0.5-8％，优选为1-5％。

25、本发明的优选技术方案中，在在步骤s-3制得的细胞蛋白提取物或步骤(2)制得的蛋白组合物中任选地加入蛋白稳定剂，其中，所述蛋白稳定剂选自白蛋白、锌盐、铝盐的任一种。

26、本发明的优选技术方案，所述细胞蛋白提取物冻干制剂或蛋白组合物冻干制剂ph6-8，优选为ph7-7.5。

27、本发明的优选技术方案中，所述神经修复蛋白组合物的分子量为20kda-250kda，优选为35kda-200kda。

28、本发明的优选技术方案，所述神经修复蛋白组合物中的蛋白组成如图2所示。

29、本发明的优选技术方案中，所述冻干制剂临用前用生理盐水或5％葡萄糖溶液复溶后，采用静脉注射、鞘内注射、腰椎穿刺的任一种或其组合方式使用。

30、本发明的优选技术方案中，所述间充质传代干细胞的培养或原代间充质干细胞的培养采用本领域的培养方法。

31、本发明的优选技术方案中，所述间充质传代干细胞的培养包括下述步骤：将原代间充质干细胞按照初始密度为5.0×105-5.0×106个/ml加入到传代培养基中，再将其置于37.0℃±0.5℃、5％±1.0％co2条件下培养10-15天，每隔2-3天，观察传代培养基变黄后，半量更换传代培养基，其中，所述传代培养基含有10％fbs、100u/ml青霉素和100ug/ml链霉素的dmem/f12培养基。

32、本发明的优选技术方案中，所述原代间充质干细胞的培养包括下述步骤：

33、1)将脐带清洗消毒后，组织解剖，取华通胶层组织，将其切成3mm3的小块，离心，清洗，收集组织块，将其置于含10％胎牛血清fbs、100ug/ml青霉素、100ug/ml链霉素的dmem/f12培养基中，再将其置于37.0℃±0.5℃、5％±1.0％co2条件下培养，每间隔2-3天半量更换培养基，培养至组织块爬出细胞；

34、2)振摇，收集低层细胞用pbs清洗后，加入0.25％的胰蛋白酶消化2min-3min，加入等体积的胰蛋白酶终止液停止消化，吸管轻轻吹打，1200-1500rpm/min*5-8min离心后，收集细胞，即得。

35、本发明的目的在于提供一种具有神经修复功效的细胞蛋白提取物的制备方法，包括如下步骤：

36、s-1:将密度为5.0×106个/ml-5.0×107个/ml的间充质传代干细胞置于含有dmem/f12 40-50％、rpmi1640 40-50％、牛血清蛋白(bsa)0.1-2％、表皮细胞生长因子(egf)1-15ug/ml、成纤维细胞生长因子(fgf)1-15ug/ml、胰岛素转铁蛋白1-15ug/ml、复方氨基酸(18aa)0.01-0.1％和2-10μmol/l应激物的培养基中，再将其置于37.0℃±0.5℃、5％±1.0％co2条件下培养2h-6h后，分离，洗涤，收集细胞，其中，所述的应激物选自化合物1-16的任一种或其组合；

37、s-2：将收集细胞按照密度为5.0×106个/ml-5.0×107个/ml分散于溶剂中，再将其置于2℃-8℃条件下超声处理，制得细胞裂解液，其中，所述溶剂选自选自生理盐水、5％葡萄糖溶液、磷酸盐缓冲液(pbs)、tbps缓冲液、tbst缓冲液、tris缓冲液的任一种或其组合；

38、s-3:将步骤s-2制得的细胞裂解液分离后，所得的分离液依次经0.45um、0.22um滤膜过滤，即得。

39、本发明的优选技术方案中，步骤s-1的培养基中含有dmem/f1242-45％、rpmi164042-45％、牛血清蛋白(bsa)0.5-1.5％、表皮细胞生长因子(egf)5-10ug/ml、成纤维细胞生长因子(fgf)5-10ug/ml、胰岛素转铁蛋白5-10ug/ml、复方氨基酸(18aa)0.02-0.05％和3-8μmol/l的应激物。

40、本发明的优选技术方案中，步骤s-1的培养基中含有dmem/f1245％、rpmi164045％、牛血清蛋白(bsa)0.5％、表皮细胞生长因子(egf)10ug/ml、成纤维细胞生长因子(fgf)10ug/ml，胰岛素转铁蛋白10ug/ml、复方氨基酸(18aa)0.05％和4-6μmol/l的应激物。

41、本发明的优选技术方案中，步骤s-1的间充质传代干细胞密度为8.0×106-2.0×107个/ml，优选为8.0×106-1.0×107个/ml。

42、本发明的优选技术方案中，步骤s-1的间充质传代干细胞在培养基中培养3h-5h，优选为3.5h-4.5h。

43、本发明的优选技术方案中，步骤s-1中洗涤细胞的溶剂选自生理盐水、5％葡萄糖溶液、磷酸盐缓冲液(pbs)、tbps缓冲液、tbst缓冲液、tris缓冲液的任一种或其组合,细胞洗涤次数为2-5次，优选为3-4次。

44、本发明的优选技术方案中，步骤s-1所述的分离选自离心、过滤的任一种或其组合，其中，所述离心条件为1000-2000rpm*3-15min，优选为1200rpm-1500rpm*5-10min。

45、本发明的优选技术方案中，步骤s-2的超声条件为：在2℃-8℃、25khz、360w条件下工作3s再间隙1s，超声处理1-5min。

46、本发明的优选技术方案中，步骤s-3所述分离选自2000-8000rpm*10-30min离心、多级离心、多级过滤的任一种或其组合，优选为3000-7000rpm*15-25min。

47、本发明的优选技术方案中，步骤s-3的多级离心依次为3000-4000rpm*3-5min、5000-6000rpm*3-5min和7000rpm*5-8min。

48、本发明的优选技术方案中，所述多级过滤的滤膜孔径选自80um、50um、30um、10um、5um的任一种。

49、本发明的优选技术方案中，将步骤s-3制得的细胞蛋白提取物冻存，优选冻存于-40℃至-20℃。

50、本发明的优选技术方案中，将步骤s-3制得的细胞蛋白提取物采用核酸酶或全能核酸酶的任一种酶解后再分离纯化。

51、本发明的优选技术方案中，所述间充质传代干细胞的培养或原代间充质干细胞的培养采用本领域的培养方法。

52、本发明的优选技术方案中，所述间充质传代干细胞的培养包括下述步骤：将原代间充质干细胞按照初始密度为5.0×105-5.0×106个/ml加入到传代培养基中，再将其置于37.0℃±0.5℃、5％±1.0％co2条件下培养10-15天，每隔2-3天，观察传代培养基变黄后，半量更换传代培养基，其中，所述传代培养基含有10％fbs、100u/ml青霉素和100ug/ml链霉素的dmem/f12培养基。

53、本发明的优选技术方案中，所述原代间充质干细胞的培养包括下述步骤：

54、1)将脐带清洗消毒后，组织解剖，取华通胶层组织，将其切成3mm3的小块，离心，清洗，收集组织块，将其置于含10％胎牛血清fbs、100ug/ml青霉素、100ug/ml链霉素的dmem/f12培养基中，再将其置于37.0℃±0.5℃、5％±1.0％co2条件下培养，每间隔2-3天半量更换培养基，培养至组织块爬出细胞；

55、2)振摇，收集低层细胞用pbs清洗后，加入0.25％的胰蛋白酶消化2min-3min，加入等体积的胰蛋白酶终止液停止消化，吸管轻轻吹打，1200-1500rpm/min*5-8min离心后，收集细胞，即得。

56、本发明的目的在于提供一种神经修复蛋白组合物的制备方法，包括如下步骤：

57、(1)在本发明的细胞蛋白提取物中加入20u/ml-35u/ml的核酸酶或全能核酸酶的任一种或其组合，将其置于37℃±1℃条件下酶解15min-40min，制得酶解液；

58、(2)在2℃-8℃条件下，将步骤(1)制得的酶解液用洗脱溶剂配置成5-15mg/ml后，过色谱柱，洗脱流速为0.1-1ml/min，监测并收集紫外波长为280nm的洗脱馏分，即得，其中，洗脱溶剂由50mmol/l磷酸盐缓冲液(ph6.8)中含300mmol/l氯化钠组成。

59、本发明的优选技术方案中，所述核酸酶选自rna核酸酶、dna核酸酶的任一种或其组合。

60、本发明的优选技术方案中，在本发明的细胞蛋白提取物中加入25u/ml-30u/ml的核酸酶或全能核酸酶的任一种或其组合，将其置于37℃±1℃条件下酶解20min-30min，制得酶解液。

61、本发明的优选技术方案中，所述神经修复蛋白组合物的分子量为20kda-250kda，优选为35kda-200kda。

62、本发明的优选技术方案中，将步骤(2)所得蛋白组合物冻存，优选冻存于-40℃至-20℃。

63、本发明的优选技术方案中，在步骤(2)收集的蛋白组合物中加入冻干保护剂，冻干，制得蛋白组合物冻干制剂，其中，所述冻干保护剂选自甘露醇、山梨糖醇、右旋糖酐、甘油、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、葡聚糖、三辛酸甘油酯(hes)、聚乙二醇、乙烯乙二烯、磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、山梨醇、淀粉中的任一种或其组合。

64、本发明的优选技术方案中，以质量百分比计，所述冻干制剂中含有冻干保护剂0.5-8％，优选为1-5％。

65、本发明的优选技术方案中，将步骤(2)收集的蛋白组合物中任选地加入蛋白稳定剂，其中，所述蛋白稳定剂选自白蛋白、锌盐、铝盐的任一种。

66、本发明的优选技术方案，所述冻干制剂ph6-8，优选为ph7-7.5。

67、本发明的优选技术方案，所述神经修复蛋白组合物中的蛋白组成如图2所示。

68、本发明的优选技术方案中，所述冻干制剂临用前用生理盐水或5％葡萄糖溶液复溶后，采用静脉注射、鞘内注射、腰椎穿刺的任一种或其组合方式使用。

69、本发明的另一目的在于提供一种神经修复组合物，所述组合物由本发明的具有神经功效的细胞蛋白提取物或神经修复蛋白组合物的任一种或其组合和药学上可接受的载体组成。

70、本发明的药学上可接受载体的用量或其种类根据组合物中有效成分的理化性质和含量、制剂类型、制剂的溶出及生物利用度等因素而定。

71、本发明的组合物可为本领域的剂型，并可采用本领域的制剂技术制备得到。

72、本发明的优选技术方案中，所述组合物选自冻干剂、凝胶剂、鼻喷剂、液体敷料、注射剂、贴剂、膏剂、霜剂、乳剂、栓剂的任一种。

73、本发明的优选技术方案中，所述组合物的给药方式选自静脉注射、鞘内注射、腰椎穿刺的任一种或其组合。

74、本发明的另一目的在于提供本发明具有神经细胞修复功效的细胞蛋白提取物、神经修复蛋白组合物或其组合物用于制备细胞修复、神经修复的任一种的制品中的应用。

75、本发明的优选技术方案中，所述神经修复选自中枢神经损伤、神经退行性疾病、脑卒中、脑外伤、共济失调、脑溢血、阿尔兹海默症、帕金森症、老年痴呆、多发性硬化症、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化症、周围性神经损伤、糖尿病、记忆力减退中的任一种病症或其并发症所致的神经损伤。

76、本发明的优选技术方案中，所述共济失调选自小脑性共济失调、大脑性共济失调、感觉性共济失调、前庭性共济失调的任一种或其并发症。

77、本发明的另一目的在于提供化合物1-16用于应激诱导干细胞产生具有修复功效的功能蛋白的应用。

78、本发明的优选技术方案中，所述修复选自细胞修复、毛囊修复、关节修复、神经修复中的任一种。

79、除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。

80、除非另有说明，本发明间充质干细胞mscs鉴定参照《standards for the cultureand quality control of umbilical cord mesenchymal stromal cells forneurorestorative clinical application》。

81、本发明采用商购试剂盒检测活性氧(iod)、超氧化物歧化酶sod、丙二醛mda水平。

82、与现有技术相比，本发明具有下述有益效果：

83、1、本发明科学筛选含有应激物的培养基应激诱导间充质干细胞产生具有细胞修复及神经修复功效的功能蛋白，所得的细胞蛋白提取物、蛋白组合物或其组合物具有细胞修复及修复神经损伤等功效，可用于修复中枢神经损伤、神经退行性疾病、脑卒中、脑外伤、共济失调、脑溢血、阿尔兹海默症、帕金森症、老年痴呆、多发性硬化症、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化症、周围性神经损伤、糖尿病、记忆力减退、小脑性共济失调、大脑性共济失调、感觉性共济失调、前庭性共济失调中的任一种病症或其并发症所致的神经损伤，并具有纯度高、稳定性好、生物利用度高、安全有效、便于生产和储运等优点。

84、2、本发明的制备方法具有操作简便，绿色环保，成本更优，适用于工业化生产等优点。