同时检测小鼠微小病毒和小鼠胸腺病毒的引物及探针组合物、检测方法、试剂盒及其应用与流程

本发明属于病毒检测，涉及同时检测小鼠微小病毒和小鼠胸腺病毒的引物和探针组合物及其应用，具体涉及一种同时检测小鼠微小病毒和小鼠胸腺病毒的双重荧光定量qpcr检测引物和探针组合物、检测方法、试剂盒及其应用。

背景技术：

1、随着重组蛋白类药物在医疗领域的广泛应用，生物制品的病毒安全问题也备受重视，啮齿类动物细胞系如中国仓鼠卵巢细胞系(cho-k1细胞)常用于蛋白质表达生产系统，以保证产品的正确构象和活性，然而无论是生物活性原材料还是复杂的生产操作过程，都不可避免地存在病毒污染的风险。

2、小鼠微小病毒(murine minute virus，mvm)为单链dna病毒，无囊膜，有极强的稳定性，易感染啮齿类动物细胞，如cho-k1、bhk21细胞等。小鼠胸腺病毒thymic virus(mtlv；murid herpesvirus 3)属于疱疹病毒科，病毒颗粒直径约为135nm，是一种含包膜的dna病毒，可感染并杀死新生小鼠胸腺内发育中的t淋巴细胞，属于一种实验动物易感病原体。ichq5a明确规定，mvm和mtlv作为啮齿类动物细胞系中的物种特异性病毒，需要进行外源因子污染检测。常用于mvm和mtlv的检测方法为病毒分离、elisa抗原检测、rt-pcr核酸检测，相比之下荧光定量qpcr检测方法更直观、快速，适合早期病毒安全风险把控。

3、目前样本中的小鼠微小病毒和小鼠胸腺病毒必须分别进行两个荧光定量qpcr检测，检测过程费工费时的技术，且市面上缺乏可同时检测mvm和mtlv的检测方法和试剂盒，为此，本发明提供了一种同时检测小鼠微小病毒和小鼠胸腺病毒的双重荧光定量qpcr检测引物和探针组合物、检测方法、试剂盒，解决了检测过程费工费时的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的是克服现有技术中小鼠微小病毒和小鼠胸腺病毒必须分别进行检测的问题。

2、为此，本发明提供了一种同时检测小鼠微小病毒和小鼠胸腺病毒的引物及探针组合物，包括检测小鼠微小病毒的上游引物p-mvm-f、下游引物p-mvm-r和探针mvm-p，检测小鼠胸腺病毒的上游引物p-mtlv-f、下游引物p-mtlv-r和探针mtlv-p；

3、所述上游引物p-mvm-f的序列为5’-aacttacttcttctgctgcaca-3’；

4、所述下游引物p-mvm-r的序列为5’-agacccagtagaaacaccaa cc-3’；

5、所述探针mvm-p的序列为5’-(fam)-ccaacctga/ixna_c/rgc graaacg-(bhq)-3’；

6、所述上游引物p-mtlv-f的序列为5’-aggacttgctttacctgttg-3’；

7、所述下游引物p-mtlv-r的序列为5’-atacatacctctccaagaacc g-3’；

8、所述探针mtlv-p的序列为5’-(fam)-ccaacctga/ixna_c/rgc graaacg-(bhq)-3’；

9、其中/ixna_a/表示对碱基a进行锁核酸修饰；/ixna_t/表示对碱基t进行锁核酸修饰；/ixna_g/表示对碱基g进行锁核酸修饰；/ixna_c/表示对碱基c进行锁核酸修饰。

10、具体的，上述引物及探针组合物还包括用于检测小鼠胸腺病毒的探针mtlv-p2；所述所述探针mtlv-p2的序列为5’-(hex)-tacattcc/ix na_c/g/ixna_c/t/ixna_t/caaac-(bhq)-3’；

11、其中/ixna_t/表示对碱基t进行锁核酸修饰；/ixna_c/表示对碱基c进行锁核酸修饰。

12、本发明还提供了一种同时检测小鼠微小病毒和小鼠胸腺病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物及探针组合物，且所述上游引物p-mvm-f、所述下游引物p-mvm-r、所述上游引物p-mtlv-f和所述下游引物p-mtlv-r混合后形成混合引物，所述探针mvm-p和所述探针mtlv-p混合后形成混合探针。优选的，混合探针中还包括探针mtlv-p2。

13、具体的，上述混合引物中上游引物p-mvm-f的浓度为0.1-1mm，下游引物p-mvm-r的浓度为0.1-1mm，上游引物p-mtlv-f的浓度为0.1-1mm，下游引物p-mtlv-r的浓度为0.1-1mm。

14、具体的，上述混合探针中探针mvm-p的浓度为0.05-1mm，探针mtlv-p的浓度为0.05-1mm。优选的，探针mtlv-p2的浓度为0.05-1mm。

15、具体的，上述试剂盒还包括qpcr反应预混液；所述qpcr反应预混液包含探针法荧光定量专用预混液aceq universal u+probe master mix v2和mg2+。

16、具体的，上述试剂盒还包括定量标准品；所述定量标准品为puc57-mvm和puc57-mtlv质粒混合物。

17、具体的，上述试剂盒还包括阳性对照；所述阳性对照为灭活的mvm毒株和mtlv假病毒毒株混合物；所述mtlv假病毒毒株的核酸信息为ul27全长序列，使用admax包装系统进行组装。

18、具体的，上述引物及探针组合物或试剂盒可用于鼠源实验动物高发病原体的早期监测，也可实时检测啮齿类生物制品、原材料、及其生产过程中是否存在小鼠微小病毒和小鼠胸腺病毒的污染。

19、本发明还提供了一种同时检测小鼠微小病毒和小鼠胸腺病毒的双重荧光定量qpcr方法，包括以下步骤：

20、(1)提取待测样本的dna模板；

21、(2)利用上述引物及探针组合物对dna模板进行荧光定量qpcr反应；

22、(3)待测样品ct值≤35，且有明显的扩增曲线时，判定待测样本小鼠微小病毒和小鼠胸腺病毒为阳性。

23、具体的，上述步骤(2)中qpcr扩增程序为95℃，10min；95℃、15s，55℃、30s，72℃、20s，41个循环。

24、与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：

25、1、本发明提供的这种引物及探针组合物、试剂盒可用于同时检测小鼠微小病毒和小鼠胸腺病毒，可以特异性扩增出mvm和mtlv这两种病毒，且不与其它病毒核酸发生交叉反应，也不会与样本中可能存在的各种常用细胞系基因组发生交叉反应，特异性良好，弥补了现有技术中小鼠微小病毒和小鼠胸腺病毒必须分别进行检测的短板。该试剂盒可用于鼠源实验动物高发病原体的早期监测，也可实时检测啮齿类生物制品、原材料、及其生产过程中是否存在小鼠微小病毒和小鼠胸腺病毒的污染，以便快速采取防范措施，将污染对动物种群生物安全、科研安全和企业的损失等影响降到最低。

26、2、本发明建立了一种同时检测小鼠微小病毒和小鼠胸腺病毒的双重荧光定量qpcr检测方法，可特异性的共检和区分小鼠微小病毒和小鼠胸腺病毒，该方法特异性强、敏感性高、重复性好，可缩短检测时间，减少样品的使用量，降低检测成本，解决了现有检测过程费工费时的技术问题，为啮齿类动物生物制品的外源病毒污染防控提供了良好的检测手段，具有一定的社会应用前景。

27、以下将结合附图对本发明做进一步详细说明。