用于单细胞测序的OCT包埋冰冻组织的细胞核提取方法与流程

本发明涉及冰冻组织的细胞核提取，特别涉及用于单细胞测序的oct包埋冰冻组织的细胞核提取方法。

背景技术：

1、oct包埋技术，是将动物组织样本用oct包埋剂(optimal cutting temperaturecompound，聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物)进行浸泡包埋，随后进行组织冰冻、切片的技术。利用oct包埋技术，在冰冻切片时可以支撑组织，以增加组织的连续性，减少皱折及碎裂。又因oct混合物为水溶性，故在漂片时可溶于水，所以在以后的染色中不会增加背景染色，使切片质量得到改善。

2、随着空间转录组技术的发展，越来越多的科研工作者利用oct包埋新鲜组织样本来进行空间转录组测序。然而，oct包埋样本因其动物组织经过冰冻后会导致组织解离得到的细胞悬液细胞活力太低，从而不宜用于单细胞测序。现有技术中，文献《从oct包埋冰冻组织中的dna提取》(董明等，中国医科大学学报，1994年第23卷第5期)提供了一种从oct包埋冰冻组织中提取dna的方法，具体使用oct包埋液、蛋白酶k、rna酶、dna提取液、te缓冲液等进行dna提取。然而这一类文献均是直接进行oct包埋冰冻组织中的dna提取，并非进行细胞裂解和细胞核提取。dna提取和细胞核提取的难度也不是一个层面的，提取dna是将整个细胞全部都破碎掉(包括细胞核)，属于分子层面。提取细胞核则只需把细胞膜破碎，保留细胞核，相比提取dna来说就比较难实现，属于是细胞层面。过度裂解或者裂解不足都会影响最终样本中的细胞核质量和数量，导致达不到单细胞测序质量要求。

3、目前尚未发现将oct包埋样本运用于单细胞测序，或用于动物细胞的细胞核提取的技术。在实验室中，在对oct包埋的动物组织(例如小鼠心脏样本)提取细胞核时，直接切片后制取的细胞核悬液中容易产生大量杂质、碎片。因此，急需一种样本处理方法，以提升oct包埋动物组织样本的细胞核提取效率和质量，解决oct包埋动物组织样本无法用于单细胞测序的难题。

技术实现思路

1、针对以上现有技术的不足，本发明提供了一种用于单细胞测序的oct包埋冰冻组织的细胞核提取方法，具体通过以下技术实现。

2、oct包埋冰冻组织的细胞核提取方法，包括以下步骤：

3、s1、切掉经过oct包埋剂包埋的冰冻组织表面的oct包埋剂，切片，剥离切片周围多余的oct包埋剂；

4、s2、在所述切片中加入裂解液，进行研磨、裂解；

5、s3、加入洗涤液混匀，过细胞筛，离心弃上清；再加入洗涤液重悬、沉淀；

6、s4、吸取上层液体过枪头筛，加入核悬液后离心弃上清，再加入核悬液重悬，完成细胞核提取。

7、本发明提供的用于单细胞测序的oct包埋冰冻组织的细胞核提取方法中，最关键的操作步骤就是步骤s1的切掉冰冻组织表面和冰冻组织切片周围多余的oct包埋剂，以及步骤s4的将经过步骤s3处理后的上层液体过枪头筛。通过按照步骤s1的方式切掉组织周围多余的oct包埋剂，使组织切片与裂解液充分接触，实现了组织细胞更有效的裂解，获取的细胞核数量更多，细胞核的形态非常完整。如果仅仅是将未切掉多余oct包埋剂的冰冻组织切片直接进行裂解，最终获取的裂解液中细胞核总量非常少，较多细胞核都已经破碎，且杂质含量很高。通过按照步骤s4的方式将经过处理的液体过枪头筛，能够进一步有效去除液体中的杂质。最终处理后的含有细胞核的液体，达到了单细胞测序的样本质量要求，此后多次重复实验结果稳定。

8、本发明所使用的oct包埋剂、裂解液、洗涤液等均可以选用行业内通用的用于动物组织冰冻切片的试剂配方。组织冷冻、切片等操作也是常规技术，所使用的切片机等仪器设备也是行业内常用的。

9、优选地，步骤s1的具体方法为：将oct包埋冰冻组织固定在切片机上，切掉组织表面的oct包埋剂，直至暴露出组织的最大切面后，收集若干片切片，剥离切片周围的多余oct包埋剂。

10、优选地，步骤s2中，所述裂解液的原料和终浓度分别为：基础缓冲液1ml、np400.2wt％、bsa0.01wt％、rnase inhibitor 1u/μl和无核酸无酶水。

11、更优选地，所述基础缓冲液的原料和终浓度分别为：nacl 292mm、tris-hcl20mm、cacl2 2mm、mgcl2 42mm和无核酸无酶水。

12、优选地，所述s3中，所述洗涤液的原料和终浓度分别为：tris-hcl 10mm、nacl10mm、mgcl2 3mm、bsa 1wt％、tween-20 0.1％、dtt 1mm、rnase inhibitor1u/μl和无核酸无酶水。

13、优选地，步骤s4中的核悬液的原料和终浓度分别为：bsa 1wt％、rnase inhibitor1u/μl和pbs缓冲液。

14、优选地，步骤s4中，过枪头筛的具体方法是：用移液器吸取步骤s3处理后的上层液体1ml，将移液器头插在枪头筛中约0.5cm的深度，在枪头筛下方放置离心管，将所述上层液体打入离心管中；重复操作一次。

15、更优选地，步骤s4中，所述枪头筛为40μm。

16、与现有技术相比，本发明的有益之处在于：本发明通过对oct包埋冰冻组织的切片进行多余oct包埋剂的去除，并且在最后用枪头筛进行处理，使得最终提取的含细胞核液体中细胞核总量明显增加，杂质明显减少，细胞核的形态完整度非常高，能够满足单细胞测序的需求。

技术特征：

1.用于单细胞测序的oct包埋冰冻组织的细胞核提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的oct包埋冰冻组织的细胞核提取方法，其特征在于，步骤s1的具体方法为：将oct包埋剂包埋冰冻组织固定在切片机上，切掉组织表面的oct包埋剂，直至暴露出组织的最大切面后，收集若干片切片，剥离切片周围的多余oct包埋剂。

3.根据权利要求1所述的oct包埋冰冻组织的细胞核提取方法，其特征在于，步骤s2中，所述裂解液的原料和终浓度分别为：基础缓冲液1ml、np400.2wt％、bsa 0.01wt％、rnaseinhibitor 1u/μl和无核酸无酶水。

4.根据权利要求3所述的oct包埋冰冻组织的细胞核提取方法，其特征在于，所述基础缓冲液的原料和终浓度分别为：nacl 292mm、tris-hcl 20mm、cacl2 2mm、mgcl2 42mm和无核酸无酶水。

5.根据权利要求1所述的oct包埋冰冻组织的细胞核提取方法，其特征在于，所述s3中，所述洗涤液的原料和终浓度分别为：tris-hcl 10mm、nacl 10mm、mgcl2 3mm、bsa 1wt％、tween-20 0.1％、dtt 1mm、rnase inhibitor 1u/μl和无核酸无酶水。

6.根据权利要求1所述的oct包埋冰冻组织的细胞核提取方法，其特征在于，步骤s4中的核悬液的原料和终浓度分别为：bsa 1wt％、rnase inhibitor 1u/μl和pbs缓冲液。

7.根据权利要求1所述的oct包埋冰冻组织的细胞核提取方法，其特征在于，步骤s4中，过枪头筛的具体方法是：用移液器吸取步骤s3处理后的上层液体1ml，将移液器头插在枪头筛中约0.5cm的深度，在枪头筛下方放置离心管，将所述上层液体打入离心管中；重复操作一次。

8.根据权利要求7所述的oct包埋冰冻组织的细胞核提取方法，其特征在于，步骤s4中，所述枪头筛为过滤孔径40μm的枪头筛。

技术总结
本发明公开了一种用于单细胞测序的OCT包埋冰冻组织的细胞核提取方法，涉及OCT包埋冰冻组织的细胞核提取技术领域，本方法先切掉经过OCT包埋剂包埋的冰冻组织表面的OCT包埋剂，切片，剥离切片周围多余的OCT包埋剂；然后在所述切片中加入裂解液，进行研磨、裂解；再加入洗涤液混匀，过细胞筛，离心弃上清；再加入洗涤液重悬、沉淀；最后吸取上层液体过枪头筛若干次，加入核悬液后离心弃上清，再加入核悬液重悬，完成细胞核提取。采用本方法提取的OCT包埋剂包埋的动物组织细胞核悬液，最终提取的含细胞核液体中细胞核总量明显增加，杂质明显减少，细胞核的形态完整度非常高，能够满足单细胞测序的要求。

技术研发人员：郝升,南春旭,李霞,丁悦,杨中正,许秀勤,王邹
受保护的技术使用者：武汉生物样本库有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13