一种严重急性呼吸综合征冠状病毒的靶点序列及其应用的制作方法

本发明涉及生物，尤其涉及一种rna病毒的靶点序列及其应用，具体为一种严重急性呼吸综合征冠状病毒的靶点序列及其应用。

背景技术：

1、rna病毒也称rna型病毒，是指遗传物质是rna的病毒。病毒rna的复制过程中，其错误修复机制的酶的活性很低很低，几乎是没有的，所以其变异很快。而疫苗是要根据病毒的固定核苷酸序列或蛋白进行开发制作的，所以rna病毒疫苗较难开发。它不可单独进行繁殖，必须在活细胞内才可进行。常见的rna病毒有：艾滋病病毒、脊髓灰质炎病毒、烟草花叶病毒、sars病毒、mers病毒、埃博拉病毒、新型冠状病毒等。冠状病毒是一类带有囊膜的不分节段的正义rna病毒，能够感染多种哺乳动物和鸟类等宿主，特别是对人类可导致轻度至中度呼吸道疾病。在过去的二十年里，人畜共患传染过程中导致了两种高致病性冠状病毒的出现：严重急性呼吸综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndrome，sars-cov)和中东呼吸综合征冠状病毒(middle east respiratory syndrome，mers-cov)。

2、核酸是生物体内遗传信息储存与传递的一个重要载体，在生物功能的调控上也发挥着极其重要的作用，随着人们对核酸的结构与功能认识的不断深入，核酸作为药物设计靶点的价值越来越被大家所重视。microrna(mirna)是一类长约22～25个核苷酸的单链短序列小rna，它不编码蛋白质，但能以其5’末端第2～8位核苷酸以非完全性碱基配对的方式结合于同源mrna的3’utr(3’非转译区)，最初人们认为mirna的发卡结构中只有其中一条链中的序列发挥调控作用，通过诱导信使rna(mrna)的降解和转录后基因沉默来负向调节基因的表达发挥功能，而另一条链会降解掉，但后来越来越多的证据发现mirna的上下链，都会作为独立的mirna发挥作用。除了mirna负向调控，有些个案报道在特殊情况下mirna能够促进基因的表达或翻译(vasudevan et al.,2007,vasudevan and steitz,2007,place etal.,2008)。xiaom等人在2015年发现例如has-mir-26a-1、has-mir-3179和has-24-1等能够与增强子结合，该结果发表在rnabiology杂志上，并在全基因组的水平上激活基因表达(xiao m,li j,li w,et al.2017.micrornas activate gene transcriptionepigenetically as an enhancer trigger.rna biol[j],14:1326-1334.)。发明人前期工作表明，mirna的这种特性并非是个例，而是适用于很多组织和细胞。在研究mirna自身的表观遗传学调控机制时，在7种不同的组织细胞中，对1594条mirna前体进行了系统分析，意外地发现有300多条mirna前体在基因组中的位置与增强子的组蛋白修饰标志h3k4mel或h3k27ac高度重叠。这让发明人将同时具有组织细胞特异性的mirna和增强子这两个重要的分子生物学事件联系起来(xiao et al.,2017)。基于此，发明人认为mirna是重要的双功能分子。当mirna位于细胞浆时，它可以作用于mrna 3’utr区域，如同灭火器一样，阻断mrna的翻译进而发挥基因的负调控作用；与此相反的是，当它位于细胞核中时，就像一个点火器，通过结合增强子改变增强子的染色质状态，从而激活基因的转录表达。发明人把定位于核内并有激活作用的rna称为namirna(nuclear activating mirna)。基于此，发明人提出了namirna-增强子-靶基因网络激活模型，用于揭示细胞核内mirna功能。令人惊喜的是，namirna与靶基因存在直接的正向调控关系，它还参与肿瘤细胞的增殖、迁移与侵袭等生物学行为。

3、透明质酸(hyaluronic acid，ha)是蛋白多糖中糖胺多糖(glycosaminoglycan，gag)的主要成分之一，也是目前研究较多的细胞外基质(extracellular matrix，ecm)成分之一，在正常组织功能和发育中发挥重要作用，包括为细胞提供支持和锚定，促进细胞间信号传导以及促进细胞移动和迁移。ha由一类称为ha合成酶(hyaluronic acid synthase，has)的整合膜蛋白合成，其中脊椎动物具有三种类型：has1、has2和has3。这些酶通过将葡萄糖醛酸和n-乙酰氨基葡糖反复添加到新生多糖中来延长ha，并通过细胞膜挤出和进入细胞外空间。ha是一种大分子黏性糖胺聚糖，可由ⅱ型肺上皮细胞、内皮细胞及肺成纤维细胞分泌，其中成纤维细胞可受致病因子，如氧自由基等的刺激合成大量ha。ha的基本结构是β-d葡萄糖酸和2-乙酰基-2-去氧-d-葡萄糖分别以β1.3和β2.4糖苷链连接的重复二糖直链分子聚合体，为最主要的糖胺多糖，ha在肺组织主要分布于毛细血管和细支气管周围的间质中，广泛表达于细胞外基质，也可表达于细胞表面。透明质酸的最大作用就是可以吸收和保存水分，一个透明质酸分子可以吸附9个水分子，透明质酸的增多无疑会加剧局部水分的增多。已有研究表明ha具有增加局部水肿并促进炎症级联反应，导致白细胞迁移、增殖和分化。

4、透明质酸合成酶抑制剂(4-methylumbelliferone，4-mu)是ha合成的选择性抑制剂。4-mu是一种香豆素家族的衍生物。其他香豆素衍生物，例如苯丙香豆素和华法林由于其抗凝机制多以预防性药物来减少心血管疾病的发生。ace2是新型冠状病毒的受体，其表达量与新型冠状病毒引起的疾病的进程有紧密的相关性。has1、has2、has3是透明质酸合成酶家族，其表达量在细胞外基质中的沉积增加与新型冠状病毒引起的疾病及其并发症有紧密的关系。fbxo15是f-box蛋白家族的成员，其表达量与炎症应答有紧密的相关性。myl9是肌球蛋白轻链9，其表达量与炎症应答有紧密的相关性。kalrn是rhogef激酶，其表达量与结节病的进程和肾脏和肺等多个脏器的炎症有相关性。atp8b1是p型阳离子转运atpase家族的成员，其表达量与炎症应答有紧密的相关性。igf2r是胰岛素样生长因子2和甘露糖6-磷酸的受体，其表达量与炎症应答有紧密的相关性。c5ar1是补体成分5a受体1，其表达量与炎症反应的调控有紧密的相关性。epas1是内皮pas结构域蛋白1，其表达量与炎症反应的调控有紧密的相关性。timm21是内线粒体膜转位酶21，其表达量与炎症反应的调控有紧密的相关性。

5、到目前为止，rna病毒尤其是新型冠状病毒引起非典型肺炎的机制并不清楚，其他相关rna病毒的致病机制和疫苗设计或生产也存在诸多问题，加之rna病毒引起的疾病缺乏有效的治疗药物和治疗方案，病毒的毒力及易感人群难以确定，迫切需要研究rna病毒的致病机制，开发rna病毒的致病性和人群易感性检测，寻找rna病毒的特效药物和治疗方案，制备高效低毒的rna病毒疫苗，为人类战胜rna病毒感染提出切实可行的中国方案。

技术实现思路

1、新型冠状病毒的rna序列大约3万个碱基，发明人前期将新型冠状病毒与人体基因组做比较时，发现新型冠状病毒核酸序列中隐含了5段人的基因组序列，长度在24-28bp不等。这5段序列在人和灵长类动物中极其保守，序列居然一个碱基也不差，这5段序列的保守性提示其具有重要意义。为了便于对其功能和应用进行研究，发明人随将上述保守序列命名为his(human insert sequence)。与此同时，发明人发现sars和mers病毒基因组中也分别有3段和2段人的基因组序列(his)。新型冠状病毒、sars、mers毒基因组中his的位置分布，主要分布在人体增强子区域，提示其与基因激活有关；sars-cov-2中的his所在增强子上下游200k范围内含有大量的炎症因子基因；his所在的rna区域可以形成病毒来源的发卡结构，进一步分析发现his可以形成发卡结构具有mirna的前体特征；以his为基础通过生物信息学分析和预测其靶基因也大多与炎症因子有关；sars病毒的和新型冠状病毒的his靶点区域有透明质酸合成酶(has)基因；根据发明人前期研究工作中发现并提出的namirna-增强子-基因激活理论(xiao et al.,2017)，发明人认为新型冠状病毒及sars病毒的his序列在病毒感染人体后会激活炎症因子，引起炎症因子风暴并可能通过激活透明质酸合成酶产生过量的透明质酸引起肺部毛玻璃样改变进而导致ards。鉴于新型冠状病毒中的his序列是冠状病毒致病的重要物质基础和重要发病机制，发明人进一步通过实验证实sars-cov-2、sars-cov以及mers病毒的his序列在细胞中过表达时能够激活包括has以及炎症因子的表达，同时细胞外的透明质酸产生增加。更加重要的是发现新型冠状病毒感染患者血清中的透明质酸含量与患者的病情严重程度密切相关。发明人认为病毒靶点序列也可以引起血液学指标的改变，结合临床数据，可用于临床病情检测。因此，冠状病毒的靶点既可以运用于临床诊断，针对该靶点设计药物治疗以及成为设计/优化疫苗的可能，这一类靶点的开发可以推广至其他rna病毒，并以典型的冠状病毒、艾滋病病毒、寨卡病毒和埃博拉病毒进行验证，获得相似的结果，尤其其他rna病毒的his序列与人体基因组配对的区域大多与这类rna病毒的致病性和特征有关联。

2、与现有技术相比，本发明采用上述技术方案，具有如下技术效果：

3、本发明通过将rna病毒的基因序列与人基因组进行对比筛选出多段与人基因组相似性为不低于95％(即互补配对为95％以上)的靶点序列，其结构稳定，且成功构建出的病毒片段具有与人基因组dna相互作用的功能，且其类似病毒mirna，同时验证了过表达rna病毒靶点序列对周围基因表达水平的影响，上述筛选及验证对rna病毒的诊断及检测、筛选药物进行rna病毒引发的病症的治疗、以及设计/优化疫苗方面均具有很好的应用价值。

4、本发明所涉及的rna病毒包括感染人的rna病毒，感染家禽家畜以及人畜共患的rna病毒。其中与人体基因组一致的靶点序列命名为his(human insert sequence)，与鸡、猪、狗、鸭基因组一致的靶点序列分别命名为cis(chicken insert sequence)、pis(piginsert sequence)、dis(dog insert sequence)、mis(mallard insert sequence)。这些病毒特定的靶点序列可以和sars-cov-2一样，可以通过增强子激活基因的表达，与病毒在人和其他物种中引起的疾病密切相关，进而做为靶标可用于病毒的毒力判断，其反义rna序列可用于药物的开发，以及缺失该靶点序列作为减毒疫苗设计的重要策略。

5、本发明克服现有技术中所存在的缺陷，提供一种rna病毒的靶点序列，其具有与人类基因组相互作用的功能，并验证了过表达rna病毒靶点序列对周围基因表达水平的影响，并将该靶点序列及其反义rna序列进行开发应用于rna病毒诊断、治疗及其设计/优化疫苗。

6、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

7、本发明的第一个方面是提供一种rna病毒的靶点序列，所述靶点序列为rna病毒核苷酸序列中包含的不小于20～40个碱基、且与人类基因组序列或相关家畜基因组序列的相似性为不低于95％(即95％以上的一致性或互补配对)的核酸序列片段。优选，与人类基因组序列相似性为不低于95％的核酸序列片段；更优选，与人类基因组序列相似性为100％的核酸序列片段。

8、为了进一步优化上述rna病毒的靶点序列，本发明采取的技术措施还包括：

9、进一步地，所述rna病毒包括严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)，所述严重急性呼吸综合征冠状病毒的靶点序列包括seq id no.1～seq id no.3。

10、进一步地，所述rna病毒还包括新型冠状病毒(sars-cov-2)、中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)、寨卡病毒(zika virus)、埃博拉病毒(ebola virus)、艾滋病病毒、诺如病毒、出血热病毒、肠病毒、克麦罗沃病毒、柯萨奇病毒、甲型肝炎病毒、登革病毒2型、风疹病毒、马尔堡病毒、脊髓灰质炎病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、澳大利亚蝙蝠狂犬病毒、汉坦病毒、波瓦生病毒、兰加特病毒、埃亚契病毒、科罗拉多蜱传热病毒、拉沙病毒、鄂木斯克出血热病毒、马丘波病毒、胡宁病毒、瓜纳瑞托病毒、辛诺柏病毒、汉他病毒、普马拉病毒、多布拉伐病毒、汉城病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、沙比亚病毒、索戈托病毒、欧洲蝙蝠丽沙病毒1型、欧洲蝙蝠丽沙病毒2型、查帕雷病毒、轮状病毒、泰林埃博拉病毒、本迪布焦埃博拉病毒、立夫特山谷热病毒、伊尔库特病毒、甲型流感病毒、长沼病毒、科萨努尔森林病毒、黑港渠病毒、日本乙型脑炎病毒、杜文哈奇-利萨病毒、lujo出血热病毒、麻疹病毒、蜱传脑炎病毒、禽流感病毒、猪流感病毒、狂犬病毒中的至少一种。

11、进一步地，所述rna病毒的靶点序列分别如表1.1所示和表1.2所示(靶点序列各片段的命名方式为病毒名加his或其他规则名称加片段序号)。

12、表1.1部分rna病毒的靶点序列表

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15、表1.2另一部分rna病毒的靶点序列表

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19、本发明的第二个方面是提供一种用于构建任一上述的rna病毒的靶点序列的引物组合物。例如，靶点序列seq id no.1的引物为seq id no.4～seq id no.7；和/或，靶点序列seq id no.2的引物为seq id no.8～seq id no.11。具体地，部分rna病毒的靶点序列的引物组合物如表2所示。

20、进一步地，在上游引物的5’端前面加上保护碱基和ecori酶切位点序列cggaattc，下游引物的5’端前面加上保护碱基和bamhi酶切位点序列cgggatcc。

21、表2–部分rna病毒的靶点序列的扩增引物序列表

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25、本发明的第三个方面是提供一种与任一上述的rna病毒的靶点序列相关的生物材料，所述生物材料选自下述a)～b)中的一种：

26、a)与任一上述的rna病毒的靶点序列互补配对的dna和/或rna分子；

27、b)含有任一上述的的rna病毒的靶点序列或a)中所述dna分子的表达盒、重组载体、重组微生物、重组细胞系。

28、可理解的是，上述dna分子、表达盒、重组载体、重组微生物、重组细胞系均可为本领域常规使用的生物材料，其均可采用本领域常规方法制备。

29、进一步地，所述生物材料为重组载体，其构建步骤包括：1)设计引物，pcr扩增所述rna病毒的靶点序列；2)将扩增的序列片段和表达载体酶切，连接目的序列片段和表达载体；3)将连接产物转化大肠杆菌，培养；4)鉴定后提取重组质粒并包装。其中，rna病毒的靶点序列如上表1.1和上表1.2所示，部分引物序列如上表2所示。

30、进一步地，所述表达载体包括但不限于pcdh载体，其他载体如pcmvp-neo-ban载体、pegfp载体、pegft-actin、psv2载体、pcdna载体、plvx载体、paav载体、pet载体、pdsred载体，其病毒相关重组载体骨架可为本领域使用的任一合适的载体。

31、进一步地，所述重组载体具有表达病毒相关靶点片段的功能；其中，所述相关靶点片段具有与人类基因组相互作用(相结合)的功能。所述重组载体上表达有任一上述的rna病毒的靶点序列，例如新型冠状病毒sars-cov-2、严重急性呼吸综合征冠状病毒sars-cov或中东呼吸综合征冠状病毒mers-cov的靶点序列等。

32、本发明的第四个方面是提供一种任一上述的rna病毒的靶点序列的应用，所述应用选自以下应用中的至少一种：在细胞水平上激活相关基因的应用、在筛选或制备用于抑制激活靶基因表达的药物中的应用、在筛选或制备用于预防或治疗rna病毒引发的病症的药物中的应用、在制备rna病毒检测或诊断试剂中的应用、在制备针对rna病毒的疫苗中的应用。

33、进一步地，所述病症包括人的疾病、动物的疾病和人畜共患病。

34、进一步地，所述药物还包括药学上可接受的载体或赋形剂。

35、进一步地，所述药物剂型包括形式可为散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、气雾剂、注射剂、乳剂或混悬剂。

36、进一步地，在筛选或制备药物时，通过直接筛选对所述靶点序列进行调控的有效物质；或者，根据所述靶点序列所调控基因的作用，筛选针对所述靶点序列所调控基因及基因产物的有效物质。

37、进一步地，所述应用为rna病毒的靶点序列在在细胞水平上激活相关基因的应用时，所述相关基因包括ace2基因、透明质酸合成酶家族has1、has2、和has3的编码基因和/或片段周围200k以内基因。

38、进一步地，所述rna病毒包括新型冠状病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒、中东呼吸综合征冠状病毒、寨卡病毒、埃博拉病毒或艾滋病病毒，更具体地为新型冠状病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒、中东呼吸综合征冠状病毒。

39、进一步地，所述片段周围200k以内基因包括但不限于fbxo15、myl9、kalrn、atp8b1、zhx2、igf2r、c5ar1、epas1、timm21。可理解的是，根据rna病毒类型的不同，其激活的相关基因也存在区别。

40、进一步地，所述rna病毒为严重急性呼吸综合征冠状病毒，seq id no.2所示的靶点序列片段过表达后ace2基因被激活；seq id no.2所示的靶点序列片段过表达后has1、has2和has3的编码基因被激活；seq id no.2所示的靶点序列片段过表达后zhx2基因被激活。

41、进一步地，所述应用为rna病毒的靶点序列在筛选或制备用于抑制激活靶基因表达的药物中的应用时，所述激活靶基因为如上所述的rna病毒的靶点序列在细胞水平上激活的相关基因，所述相关基因如上所例举；其中，所述应用为利用所述rna病毒的靶点序列或其反向互补序列筛选或制备用于抑制激活靶基因表达的药物，所述反向互补序列包括反向互补rna序列或反向互补dna序列(例如，利用rna病毒靶点序列的反向互补序列，rna病毒的靶点序列或其反向互补序列的3’端进行胆固醇修饰和四个硫代骨架修饰，5’端进行两个硫代骨架修饰)。具体地，所述药物包括mirna抑制剂。

42、进一步地，所述用于抑制激活靶基因表达的药物为病毒靶点抑制剂antagomir，其将所述rna病毒的靶点序列的反向互补序列的3’端进行胆固醇修饰和四个硫代骨架修饰，5’端进行两个硫代骨架修饰，全链进行甲氧基修饰，得到相对应的病毒靶点抑制剂antagomir。

43、进一步地，所述应用为rna病毒的靶点序列在筛选或制备用于预防或治疗rna病毒引发的病症的药物中的应用时，所述rna病毒引发的病症为靶点序列引起透明质酸含量上升从而引发的病症，所述用于预防或治疗rna病毒引发的病症的药物为透明质酸抑制剂4-mu。具体地，所述rna病毒包括新型冠状病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒、中东呼吸综合征冠状病毒。

44、可理解的是，上述药物还可包括其他能抑制被激活靶基因的药物以及其他可调节透明质酸水平(抑制透明质酸合成、降低透明质酸浓度等)的药物。

45、进一步地，所述应用为制备针对rna病毒的疫苗中的应用时，在疫苗设计过程中敲除所述靶点序列。例如，敲除所述靶点序列的方法包括：crispr系统和/或核酶技术。crispr来自微生物的免疫系统，这种工程编辑系统利用一种酶，能把一段作为引导工具的小rna切入dna，就能在此处切断或做其他改变。以往研究表明，通过这些介入，crispr能使基因组更有效地产生变化或突变，效率比talen(转录激活因子类感受器核酸酶)等其他基因编辑技术更高。虽然crispr有许多优点，在人类癌细胞系列中，它也可能产生大量“误伤目标”，尤其是对不希望改变的基因做修改。核酶技术属于一种利用核酶的技术，主要是可以进行核酶的设计以进行应用。核酶属于一种能序列特异性剪切rna的rna分子，其可以被设计。经过设计的核酶可以用来选择特异性的mrna片段，也可以通过结合特异性mrna来阻断其表达。因此，这项技术可以用来进行rna结构的研究，还可用于异常基因表达导致疾病的治疗。

46、进一步地，所述疫苗为减毒活疫苗。

47、本发明的第五个方面是提供了一种减毒活疫苗，所述减毒活疫苗的全基因组不包含上述的rna病毒的靶点序列。

48、本发明的第六个方面是提供rna病毒的靶点序列在研究针对rna病毒所致疾病的药物靶点中的应用。

49、进一步地，在rna病毒所致疾病的细胞中找到rna病毒的靶点序列，并在rna病毒的靶点序列周围200k以内寻找药物靶点或使用预测软件blast 2.2.30或bedtools 2.29.2在200k以外寻找药物靶点。

50、本发明的第七个方面是提供一种检测病毒的方法，对上述的rna病毒的靶点序列进行检测。进一步地，所述靶点序列的检测包括rcr扩增和核苷酸测序。

51、进一步地，这种对rna病毒的靶点序列进行检测，可用以判断病毒性疾病的诊断，致病性判断及人群易感性检测。