抗猪星状病毒五型PAstV5单克隆抗体、引物、杂交瘤细胞株、制备、应用

本发明涉及猪星状病毒检测，更具体地说，涉及一种抗猪星状病毒五型pastv5单克隆抗体及其引物、制备方法和应用。

背景技术：

1、猪星状病毒pastv首次由bridger通过电镜在3周龄的乳猪腹泻粪样中观察到，pastv感染猪后可引起腹泻、呕吐、脱水和生长迟缓等临床症状，pastv常与冠状病毒、嵌杯状病毒、轮状病毒及其他肠道病毒混合感染造成猪急性胃肠炎。有学者认为pastv是引起近年来仔猪病毒性腹泻疫情的主要病原之一，对断奶前仔猪侵害尤为严重，给养猪业带来了巨大影响。

2、星状病毒无囊膜，为单股、正链rna病毒，基因组全长6.4–7.8kb，病毒颗粒直径大约是28–30nm。星状病毒由5’和3’非翻译区(untranslated region，utr)、三个开放阅读框open reading frames(orf1a、orf1b、orf2)和poly(a)组成。orf1a和orf1b位于基因组的5’端，在orf1a/b的交界处有一个七核苷酸(aaaaaac)的核糖体框架移位信号(rfs)，序列高度保守。整个orf1编码非结构蛋白nsp1a和nsp1ab，它们通过蛋白水解加工成较小的蛋白，包括rna依赖性rna聚合酶，丝氨酸蛋白酶，病毒基因组相关蛋白(vpg)和其他几种功能未知的蛋白质。orf2编码结构蛋白(衣壳蛋白cp)。在所有星状病毒中，衣壳蛋白的n末端比c末端更加保守，因为所有星状病毒的衣壳蛋白均在n端包含一个富含碱性氨基酸(精氨酸和赖氨酸)区域，该区域被认为与病毒内部的基因组rna相互作用。

3、星状病毒具有基因多型性与变异性,可以发生基因重组,使其具有不俗的适应宿主能力和跨种间传播能力,具有潜在的人畜共患风险。orf1a区域内可以发生基因重组，除此之外，orf1b和orf2的重叠区是发生同源重组的高频区域，该区域内含有一个相对稳定的发夹结构，重组主要发生在这个发夹结构区域。

4、jonassen等人研究发现人、猫星状病毒和pastv遗传距离最相近，提示星状病毒在进化过程中存在种间交叉传播，有可能是猪传给猫、猫再传给人或者通过中间宿主进行传播。ulloa等人发现，来自住在同一栋房子的人及猪腹泻样品中人星状病毒和pastv部分基因出现重组，认为星状病毒可能存在种间交叉传播。星状病毒的多宿主性、基因差异性及其重组现象和跨种间传播及适应新宿主的能力，使得星状病毒成为潜在的新兴人畜共患病原，因此，对猪星状病毒的及时检测发现并控制具有重要的公共卫生价值。

5、目前已发现的猪星状病毒基因型共有5种(poastv1-5)，序列分析表明五种基因型之间差异很大，基因组彼此间同源性只有40％左右，这也反映出poastv间巨大的遗传差异，这也导致对这五种猪星状病毒的检测方法的差异性非常大，相互之间的借鉴意义很小。

6、在猪星状病毒的抗体检测方面，针对猪星状病毒1型的检测研究较多，例如《猪星状病毒1型衣壳蛋白的截短表达及多克隆抗体的制备》(中国预防兽医学报，王蔚怡等，2021.4)公开了一种猪星状病毒1型多克隆抗体的制备方法，该方法根据pastv-gx1株cap蛋白cs(aa420-aa669)基因序列设计引物，pcr扩增该片段(cs)后克隆于pet-32a(+)原核表达载体，构建重组表达质粒pet32a-cs，将其转化e.coli bl21感受态细胞，经终浓度1mmol/l的iptg在37℃诱导6h后经sds-page检测表达产物，结果显示在大约47ku处出现目的蛋白，且该蛋白以可溶性形式表达。将重组cs蛋白经ni柱纯化后乳化，按100μg/只免疫6周龄balb/c小鼠，三免后5d采血分离血清，经western blot和间接免疫荧光检测结果显示，获得的cap蛋白高变区多克隆抗体可特异性识别pastv-gx1感染的pk15细胞表达的病毒蛋白。

7、但是，对其他型的猪星状病毒的抗体检测还未见报道，特别是对猪星状病毒5型的检测，难度更大一些，这主要是跟猪星状病毒5型的结构有关系。

8、2011年在加拿大养猪场成年猪盲肠内粪便标本中发现一种新型pastv，这种pastv无法用病毒通用引物检测，因为这株病毒并没有在多种病毒内均存在的高度保守的s2m茎环结构。对毒株进行系统发育分析，发现其在哺乳动物病毒科中形成了一个独特的谱系，这株pastv与经典型的poastv-1仅有25％-30％的氨基酸同源性，且与其他三种pastv基因型均存在一定的遗传距离，于是将其命名为pastv-5。

9、中国国内第一株pastv-5(kp747574)序列是2015年在健康家养仔猪中检测到的，且中国最早发现的三株poastv-5并不分布在同一进化枝上，呈现较为复杂的分布，poastv-5的遗传性多样且复杂。因此，如何开发一种与pastv5血清特异性结合效果好且效价较高的酶标抗体具有重要的意义。

技术实现思路

1、为了提高抗体与pastv5血清特异性结合效果，本技术提供一种抗猪星状病毒五型pastv5单克隆抗体及其引物、制备方法和应用。

2、一种抗猪星状病毒五型pastv5单克隆抗体制备用pcr引物，所述引物的核苷酸序列如下：

3、p1:5’-ggatccgggtctggcaatcttgagattgaaggt-3’；

4、p2:5’-aagcttaggattcatgttccaatttgtaaactgccatgtggcgcg-3’。

5、一种抗猪星状病毒五型pastv5单克隆抗体，由保藏编号为cctcc n0:c2022393的杂交瘤细胞株产生。

6、一种抗猪星状病毒五型pastv5单克隆抗体制备用杂交瘤细胞株，保藏编号为cctcc n0:c2022393。

7、一种抗猪星状病毒五型pastv5单克隆抗体制备用杂交瘤细胞株的制备方法，包括如下步骤：

8、1)采用pet32a-pastv5-cap-1融合蛋白对小鼠进行免疫；

9、2)取步骤1)中免疫小鼠的脾细胞与sp2/0细胞进行融合制备杂交瘤细胞；

10、3)对步骤2)制得的杂交瘤细胞进行筛选，得到阳性杂交瘤细胞；

11、4)对步骤3)筛选得到的阳性杂交瘤细胞进行亚克隆，筛选得到所述单克隆抗体细胞株。

12、步骤3)中采用间接elisa方法筛选。

13、上述pet32a-pastv5-cap-1融合蛋白利用上述引物扩增、克隆、重组、融合、纯化得到。

14、利用上述引物进行pcr扩增时以仔猪粪便为模板。仔猪粪便中含有猪星状病毒五型。pcr反应体系为：primer star 25ul、dna模板(cdna)2ul、上游引物(10μmol/l)1ul、下游引物(10μmol/l)1ul、双蒸水21ul。总体积为50ul。pcr反应程序为：98℃5min、98℃30s、61.6℃30s、72℃1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。

15、对pcr扩增产物克隆时，是对扩增产物进行培养，得到单克隆。采用通用引物进行菌液pcr鉴定，获得阳性克隆。

16、其中，通用引物序列如下：

17、p1：5’-cgaacgccagcacatggaca-3’；

18、p2：5’-tgctagttattgctcagcgg-3’；

19、pcr反应体系为：

20、rtaq 12.5ul、dna模板(菌液)2ul、上游引物(10μmol/l)0.5ul、下游引物(10μmol/l)0.5ul、双蒸水9.5ul。总体积为25ul。

21、pcr反应程序为94℃5min，94℃30s，61.6℃30s，72℃1min，共35个循环；最后72℃延伸5min。

22、重组时，将上述得到的阳性克隆经过扩大培养，提取质粒pet32a-pastv5-cap-1，菌液pcr鉴定后进行测序。将测序正确的阳性质粒pet32a-pastv5-cap-1转化大肠杆菌感受态bl21(de3)，并进行pcr鉴定，获得重组表达菌株pet32a-pastv5-cap-1/bl21(de3)。

23、融合时，将上述重组表达菌株进行诱导，即得。诱导时的诱导剂(操纵子)为iptg，使用时采用终浓度为100mmol/l的iptg液。诱导条件为37℃、220rpm。得到的融合蛋白为38kd。

24、纯化时，采用超声对诱导表达后的蛋白进行破碎。

25、一种抗猪星状病毒五型pastv5单克隆抗体的制备方法，利用保藏编号为cctccn0:c2022393的杂交瘤细胞株在小鼠腹腔内进行诱生增殖，制得所述抗猪星状病毒五型pastv5单克隆抗体。

26、一种抗猪星状病毒五型pastv5单克隆抗体的在检测猪星状病毒五型方面的应用。

27、所述应用为elisa检测、wb检测或ifa检测。

28、所述应用是制备猪星状病毒五型pastv5间接elisa检测试剂盒，该试剂盒包含上述的抗猪星状病毒五型pastv5单克隆抗体。

29、综上所述，本技术具有以下有益效果：

30、本发明表达纯化的pastv5 cap蛋白能与pastv5阳性血清反应，具有良好的免疫原性；将纯化好的蛋白免疫小鼠，筛选单克隆抗体，杂交瘤细胞株能够稳定的分泌抗体。本发明制备的单克隆抗体elisa效价可达到50万倍以上，并可应用于elisa、wb、ifa中对pastv5的检测。