一种从微藻毛油制备多不饱和脂肪酸甘油酯的方法与流程

本发明涉及不饱和脂肪酸甘油酯制备领域，具体涉及一种从微藻毛油制备多不饱和脂肪酸甘油酯的方法。

背景技术：

1、不饱和脂肪酸(pufas)是人体必需脂肪酸，不饱和脂肪酸根据双健个数的不同，分为单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸二种，多不饱和脂肪酸在人体生理中至关重要，对心血管疾病的控制、免疫调节、细胞生长以及抗癌方面均有作用。摄入多不饱和脂肪酸可降低血液中的胆固醇等不良脂质。临床研究表明，γ-亚油酸有降脂效果，对甘油三酯、胆固醇等的下降有效性达60﹪以上，并能防止血栓形成。藻油是一种纯植物性不饱和脂肪酸原料，从人工培育的海洋微藻中提取，未经食物链传递，是目前最纯净、最安全的dha来源。

2、从藻油毛油或是藻油硬酯中富集pufas，经由水解，分离、富集等步骤。一方面，藻油水解传统工艺主要是通过化学法水解，局限性在于，工段中使用大量的强酸强碱以及有机溶剂，反应温度高，且水洗处理过程中产生大量的废水，污染环境；藻油水解也可也可以采用酶法水解获得，但是目前酶法水解对于藻油的要求较高，需要将藻油精炼除杂脱色等才能试用酶法水解，同时酶法水解效率较低也影响了其工业推广运用。另一方面，水解得到的游离脂肪酸必须通过富集得到多不饱和脂肪酸，传统的富集方法主要包括：尿素包合法、金属盐沉淀法、低温冷冻法、超临界气体萃取法等。蔡双飞等人用尿素包合法处理多不饱和脂肪酸甲酯，甲酯pufa的含量由47.7％提高到86.7％，但是，尿素包合工段中使用大量的有机溶剂，且尿素必须滤除，收率低；郑公铭等将盐析法和尿素包合法相结合，对海洋动物中的dpa等pufas进行纯化，最终dpa等pufas的比例达到了酸的70％～75％，但是，过程中的盐类物质无法重复利用，对环境造成较大污染；王晓玲等人利用结晶法，在低温条件下对一种昆虫中的pufas进行富集，在-8℃时，原料中两种pufas的含量分别提高了17.08％和6.59％，但是，过程中使用大量有机溶剂，有残留，产率较低；超临界气体萃取法，v.riha等人利用该方法对非游离型的dha产品进行纯化，pufa总含量可达96％，缺点在于设备成本高于一般方法。综上，传统的水解和富集方法，要么是使用大量的有机溶剂，污染环境，要么是设备成本高、产率低、油损耗高。因此，寻求一种绿色高效的水解和富集方法，分离纯化得到高纯度的多不饱和脂肪酸具有十分重要的研究价值和应用前景。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提出了从微藻毛油制备高纯度多不饱和脂肪酸甘油酯的方法，其目的是提供一种可直接从微藻发酵制得的毛油中高效、专一水解获得多不饱和脂肪酸，然后通过脂肪酶催化酯化制得高纯度多不饱和脂肪酸甘油酯，制得的多不饱和脂肪酸甘油酯纯度和制备效率都得到了显著提升，降低了油损耗，保证了酶法水解得到的不饱和脂肪酸品质，便于酶解法在不饱和脂肪酸制备中的推广应用。

2、为了实现上述目的，本发明提供了一种从微藻毛油制备多不饱和脂肪酸甘油酯的方法，包括以下步骤：

3、s1、微藻毛油水解：米曲霉masl-01(aspergillus oryzae masl-01)经发酵后，添加微藻发酵制得的毛油与水混合的混合物，搅拌反应后分离出脂肪酶，水化层经酸化，静置，离心，水洗，除水，过滤及蒸发，获得游离脂肪酸；

4、s2、薄膜蒸发：将所述s1得到的游离脂肪酸在薄膜蒸发器中富集，收集重组分进行下一步；

5、s3、分子蒸馏富集：将所述s2收集的重组分进行四级分子蒸馏，得到高纯度多不饱和脂肪酸；

6、s4、酶法合成：将米曲霉masl-01(aspergillus oryzae masl-01)发酵后，添加所述s3分子蒸馏富集得到的高纯度不饱和脂肪酸和甘油，混合，搅拌反应，酯化转化率达到95％～99％时反应结束，将反应液离心分离得到高纯度多不饱和脂肪酸甘油酯；

7、所述米曲霉masl-01(aspergillus oryzae masl-01)，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为gdmcc no.63015。

8、作为优选，所述s1和s4中米曲霉masl-01的发酵过程包括以下步骤：

9、s11、取接种于斜面培养基的米曲霉菌株masl-01活化获得活化菌株；

10、s12、取斜面活化菌种接入一级种子培养基中，得到一级种子培养菌种；取一级种子培养菌种接入二级种子培养基中，得到二级种子菌种；将二级种子菌种接入三级种子培养罐中，得到三级种子培养液；

11、s13、将三级种子培养液通过移料管接种至发酵罐中，得到发酵液，发酵液经处理收集得到粗酶，粗酶经纯化收集得到脂肪酶。

12、作为优选，所述s1中脂肪酶添加量为50～500单位/油脂，

13、所述s4中脂肪酶加入酶量为不饱和脂肪酸质量的5％～10％。

14、作为优选，所述步骤s1中毛油与水的混合质量比为1:0.2～0.6。

15、作为优选，所述s1搅拌反应温度为40℃～45℃，搅拌反应水解时间为12～48h。

16、作为优选，所述s1中搅拌反应过程中当水解率达到30％～50％时添加中和剂进行酸中和，所述中和剂为氢氧化钠或者氢氧化钾。

17、作为优选，所述s2中薄膜蒸发器温度为80℃～110℃，冷凝面温度为50℃～60℃，真空度为1～10pa。

18、作为优选，所述s3中四级分子蒸馏具体为：

19、一级分子蒸馏，蒸发器温度110℃～120℃，冷凝面温度45℃～75℃，真空度0.1～0.3pa；保留一级分子蒸馏后的重组分进行二级分子蒸馏，蒸发器温度115℃～140℃，冷凝面温度55℃～90℃，真空度0.1～0.3pa；

20、保留二级分子蒸馏后的重组分进行三级分子蒸馏，蒸发器温度140℃～170℃，冷凝面温度65℃～90℃，真空度0.1～0.3pa；

21、保留三级分子蒸馏后的重组分进行四级分子蒸馏，蒸发器温度170℃～200℃，冷凝面温度65℃～90℃，真空度0.1～0.3pa，保留轻组分，离心过滤，得到高纯度的多不饱和脂肪酸。

22、作为优选，所述s4中不饱和脂肪酸和甘油混合质量比为1:0.166～0.3。

23、作为优选，所述s4中搅拌反应时间6h～24h，搅拌反应温度为40℃～45℃。

24、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

25、1、本发明提供的从微藻毛油制备多不饱和脂肪酸甘油酯的方法，直接将微藻发酵制得的毛油进行水解，利用脂肪酶的高活性和对于甘油酯sn-1,3位置的专一性催化能力，可以将毛油中含有的甘油酯高效专一水解获得不饱和脂肪酸(dha和dpa)，最后通过该高活性脂肪酶专一性高效催化不饱和脂肪酸转化得到高纯度甘油酯，该方法显著减低了对于反应原料的要求，减少了毛油处理步骤，同时提高了毛油的水解效率，毛油水解时间缩短50％以上，水解率可以达到99％，后续酶法合成甘油酯的转化率也达到95～99％；与此同时，由于选用了特定高活性和高水解率的脂肪酶进行水解，提高了水解效率，降低了脂肪酶使用量，从而明显减少了水解和酯化过程的油损耗率，最终毛油中含有的不饱和脂肪酸收率可以达到75～80％；

26、2、该方法可以使用藻油硬酯和塑化剂超标的毛油为初始原料，原料来源广泛、成本低廉，且解决了废弃藻油处理问题；

27、3、该方法与传统化学法水解相比，酶法水解，酶法合成均避免使用有机溶剂，高效绿色，反应条件温和，藻油水解率和酯化转化率都得到了明显提高；采用薄膜蒸发器与多级分子蒸馏串联富集多不饱和脂肪酸，明显地提高了pufas纯度和生产效率，pufas含量达到95～99％；

28、4、该方法提高了生物催化毛油水解的水解率，降低了酶法水解和酶法催化酯化的反应时间，减少了油损耗率，显著提高了多不饱和脂肪酸甘油酯的生产效率、产品纯度和品质，便于工业化推广应用。

29、生物材料的保藏：

30、米曲霉masl-01(aspergillus oryzae masl-01)，于2022年11月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为gdmcc no：63015。