过表达ald基因的耐铵固氮微生物及其构建方法与应用

本发明涉及基因工程和微生物领域，具体地说，涉及一种过表达ald基因的耐铵固氮微生物及其构建方法与应用。

背景技术：

1、氮素是植物生产中必需的最大元素。化学氮肥在保障我国粮食生产、蔬菜种植和果树栽培中起着十分重要的作用。但长期过量偏施化学氮肥，导致土壤酸化和盐渍化，土壤微生物活力下降，己成为农业可持续发展的一个重要制约因子。

2、固氮微生物在常温常压下，利用体内的固氮酶能将空气中的氮气还原成铵，供植物生长利用。但固氮效率受铵浓度的影响，即，在限铵或铵浓度低时固氮，铵浓度一般大于5mm以上抑制固氮。在贫瘠的土壤里，固氮微生物的固氮效率高，而在肥沃的土壤里，只生长但不固氮。因此，获得在高铵条件下固氮的微生物，在农业生产中具有重要的应用价值。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种过表达ald基因的耐铵固氮微生物及其构建方法与应用。

2、本发明构思如下：ald基因存在于部分微生物中，ald基因编码的丙氨酸脱氢酶催化丙氨酸合成和分解，而丙氨酸的合成前体为丙酮酸，因而在碳氮代谢中起到中间桥梁的作用。本发明首次发现，在固氮类芽孢杆菌中，高铵固氮现象与丙氨酸脱氢酶相关。

3、为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种过表达ald基因的耐铵固氮微生物，所述耐铵固氮微生物是通过在类芽孢杆菌属(paenibacillus)微生物中过表达来自类芽孢杆菌属微生物的ald基因获得的。

4、所述过表达的途径可选自以下1)～6)，或任选的组合：

5、1)通过导入具有所述基因的质粒而增强；

6、2)通过增加染色体上所述基因的拷贝数而增强；

7、3)通过改变染色体上所述基因的启动子序列而增强；

8、4)通过将强启动子与所述基因可操作地连接而增强；

9、5)通过导入增强子而增强；

10、6)通过使用具有编码高活性丙氨酸脱氢酶的基因或等位基因而增强。

11、所述ald基因可以来自多粘类芽孢杆菌(paenibacillus polymyxa)、固氮类芽孢杆菌(paenibacillus sabinae)等。

12、在本发明的一个具体实施方式中，ald基因来自多粘类芽孢杆菌wly78，其核苷酸序列为：

13、i)seq id no:1所示的核苷酸序列；

14、ii)seq id no:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；

15、iii)在严格条件下与seq id no:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％ sds的0.1×sspe或含0.1％ sds的0.1×ssc溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

16、iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

17、ald基因编码的丙氨酸脱氢酶的氨基酸序列如seq id no:4所示。

18、可选地，ald基因过表达是通过如下方式实现的：将ald基因启动子区(seq idno:5)的转录调控因子glnr结合位点(glnr结合位点的序列为：tgtcattttacatgaca)中的tgtcat替换为ggatcc(bamh i酶切位点)。

19、进一步地，出发菌株可以是多粘类芽孢杆菌，优选多粘类芽孢杆菌wly78。

20、第二方面，本发明提供一种过表达ald基因的耐铵固氮微生物的构建方法，包括如下步骤：

21、(1)利用引物aldpf和aldr(seq id no:2和3)，以多粘类芽孢杆菌(paenibacilluspolymyxa)wly78基因组为模板pcr扩增得到长1329bp的片段；用tiangen胶回收试剂盒切胶回收片段；

22、(2)用bamhi和hindiii酶切质粒phy300plk，得到酶切片段；

23、(3)将步骤(1)的回收片段和步骤(2)的酶切片段，通过gibson组装得到重组载体phy78ald；

24、(4)将重组载体phy78ald转化到多粘类芽孢杆菌wly78感受态细胞中，筛选具有四环素抗性的菌株，即得。

25、优选地，步骤(4)的转化为电击转化。

26、第三方面，本发明提供ald基因在诱导类芽孢杆菌属微生物在高铵条件下进行固氮的应用。

27、所述应用包括：利用基因工程手段，使所述微生物过表达ald基因，以诱导类芽孢杆菌属微生物在高铵条件下进行固氮。

28、所述ald基因来自类芽孢杆菌属微生物，优选多粘类芽孢杆菌、固氮类芽孢杆菌，更优选多粘类芽孢杆菌wly78。

29、出发菌株可以是多粘类芽孢杆菌，优选多粘类芽孢杆菌wly78。

30、前述的应用，所述高铵条件指微生物所处环境中nh4+的浓度为30～400mm。

31、借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

32、本发明提供一种耐铵固氮微生物，在限铵和高铵条件下都能进行生物固氮，通过过表达多粘类芽孢杆菌wly78中的ald基因，成功赋予了菌株高铵固氮能力，突破了高铵条件对生物固氮的抑制作用，在农业生产中具有广阔的应用前景。

技术特征：

1.过表达ald基因的耐铵固氮微生物，其特征在于，所述耐铵固氮微生物是通过在类芽孢杆菌属(paenibacillus)微生物中过表达来自类芽孢杆菌属微生物的ald基因获得的；

2.根据权利要求1所述的耐铵固氮微生物，其特征在于，所述ald基因来自多粘类芽孢杆菌(paenibacillus polymyxa)、固氮类芽孢杆菌(paenibacillus sabinae)。

3.根据权利要求2所述的耐铵固氮微生物，其特征在于，所述ald基因的核苷酸序列为：

4.根据权利要求1所述的耐铵固氮微生物，其特征在于，将ald基因启动子区的转录调控因子glnr结合位点中的tgtcat替换为ggatcc。

5.根据权利要求1-4所述的耐铵固氮微生物，其特征在于，出发菌株为多粘类芽孢杆菌，优选多粘类芽孢杆菌wly78。

6.过表达ald基因的耐铵固氮微生物的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(4)的转化为电击转化。

8.ald基因在诱导类芽孢杆菌属微生物在高铵条件下进行固氮中的应用；

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，出发菌株为多粘类芽孢杆菌，优选多粘类芽孢杆菌wly78。

10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述高铵条件指微生物所处环境中nh4+的浓度为30～400mm。

技术总结
本发明公开了过表达ald基因的耐铵固氮微生物及其构建方法与应用。所述耐铵固氮微生物是通过在类芽孢杆菌属微生物中过表达来自类芽孢杆菌属微生物的ald基因获得的。本发明构建的耐铵固氮微生物，在限铵和高铵条件下都能进行生物固氮，突破了高铵条件对生物固氮的抑制作用，在农业生产中具有广阔的应用前景。

技术研发人员：陈三风,李琴
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13