抗CTLA-4抗体药物组合物及其用途的制作方法

本发明涉及治疗性药物组合物领域，具体涉及抗ctla-4抗体药物组合物及其用途。

背景技术：

1、细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(ctla4或ctla-4，cytotoxic t-lymphocyte-associated protein 4)，也称为cd152(cluster of differentiation 152)，是由ctla-4基因编码的跨膜蛋白，该基因位于人类第2号染色体2q33。ctla-4是免疫球蛋白超家族的一员，由胞外v区、跨膜区和胞浆区组成。ctla-4与t细胞表面的协同刺激分子受体cd28具有同源性，两者竞争结合其配体b7-1(cd80)和b7-2(cd86)，这类配体主要表达于抗原递呈细胞表面。与cd28相比，ctla-4与cd80和cd86的结合亲和力更高，因此能够竞争和阻断cd28介导的激活作用。ctla-4通常表达在调节性t细胞(treg)和活化状态的常规t细胞表面上。其在与b7类分子结合后，抑制t细胞的激活，参与免疫反应的负调控，充当免疫检查点并下调免疫应答，所以ctla-4在免疫调节中起到非常重要的作用。

2、t细胞的激活需要两个信号的刺激，第一个信号来自t细胞受体(tcr)特异性结合抗原递呈细胞(apc)表面的抗原肽-mhc复合物，第二个信号通路需要共刺激分子(如cd28)的参与，当cd28与b7-1/b7-2(cd80/cd86)结合后可以进一步活化t细胞，促进其成熟和增殖。目前的研究表明，在免疫应答过程中，ctla-4通过下列途径下调t细胞的功能：其一，ctla-4可以通过其与cd80/cd86的高亲和力，竞争性阻断cd28与cd80/86共刺激信号的传递，进而抑制t细胞的增殖，减少il-2的分泌。其二，ctla-4可以通过降低cd80/cd86在抗原递呈细胞(apc)上的表达水平或者通过反式内吞作用将cd80/cd86分子从抗原递呈细胞(apc)表面移除，从而减少了cd28参与的t细胞激活。其三，ctla-4可以通过介导树突状细胞结合cd80/cd86并诱导色氨酸降解酶ido的表达，抑制tcr信号。此外，ctla-4还可以通过招募抑制性分子结合到免疫突触，诱导产生调节性细胞因子，从而抑制apc和tcr信号的传递。

3、已在许多研究中证明ctla-4的阻断可以诱导肿瘤消退。抗ctla-4抗体能够在体内外有效、特异地抑制细胞和体液免疫应答，对移植排斥反应及各种自身免疫性疾病有显著的治疗作用，毒副作用低。

4、尽管目前已有ctla-4的单抗药物ipilimumab(百时美施贵宝)和tremelimumab(阿斯利康)用于一些癌症治疗并且正在测试其他抗癌适应症，但是仍需要在各方面包括活性相比于已知抗体改善的新型抗ctla-4抗体。

5、但是，抗体药物其分子量大，结构复杂，容易降解、聚合或发生不希望发生的化学修饰等而变得不稳定。为了使抗体适合于生产和给药，并且在储存和随后使用过程中能保持稳定性，及发挥更好的效果，抗体药物的稳定制剂研究显得尤为重要。

技术实现思路

1、本发明所述的药物组合物是一种含有与ctla-4特异性结合的抗体或其抗原结合片段的高稳定性药物组合物。特别地，本发明通过选择适当的缓冲体系和ph，优化稳定剂和表面活性剂，开发得到的抗体制剂可用于静脉注射，且各成分之间相互作用、协同配合，为抗ctla-4抗体或其抗原结合片段提供了适宜长期保存的存储环境，能够避免制剂在长期保存或运输过程中导致的抗体降解、聚集或沉淀，抗体在该环境中可以长期存储，存储期间能够保证抗体活性和纯度均保持稳定，保证了生物药物的药效。

2、本发明提供了一种药物组合物，包含：(1)缓冲液；(2)抗ctla-4抗体或其抗原结合片段。

3、在一些方案中，上述抗ctla-4抗体或其抗原结合片段包含的lcdr1、lcdr2、lcdr3、hcdr1、hcdr2和hcdr3分别为：

4、lcdr1：rasqnvgtyva(seq id no:1)；

5、lcdr2：stsyrys(seq id no:2)；

6、lcdr3：hqydtyplt(seq id no:3)；

7、hcdr1：sgyywn(seq id no:4)；

8、hcdr2：yigydgsnx1ynpslkx2，其中，x1为n或y，x2为s或n；

9、hcdr3：x3yysgyfds，x3为d或n。

10、在一些方案中，上述抗ctla-4抗体或其抗原结合片段包含：

11、氨基酸序列如seq id no:1所示的lcdr1；

12、氨基酸序列如seq id no:2所示的lcdr2；

13、氨基酸序列如seq id no:3所示的lcdr3；

14、氨基酸序列如seq id no:4所示的hcdr1；

15、氨基酸序列如seq id no:5或7或9所示的hcdr2；

16、氨基酸序列如seq id no:6或8所示的hcdr3。

17、在一些方案中，上述抗ctla-4抗体或其抗原结合片段包含：

18、(1)氨基酸序列分别如seq id no:1、seq id no:2和seq id no:3所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和氨基酸序列分别如seq id no:4、seq id no:5和seq id no:6所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；或

19、(2)氨基酸序列分别如seq id no:1、seq id no:2和seq id no:3所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和氨基酸序列分别如seq id no:4、seq id no:7和seq id no:8所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；或

20、(3)氨基酸序列分别如seq id no:1、seq id no:2和seq id no:3所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和氨基酸序列分别如seq id no:4、seq id no:9和seq id no:6所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3。

21、在一些方案中，上述抗ctla-4抗体或其抗原结合片段选自鼠源抗体或其抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原结合片段、人源化抗体或其抗原结合片段，优选为人源化抗体或其抗原结合片段。

22、在一些方案中，上述抗ctla-4抗体或其抗原结合片段包含：

23、(1)氨基酸序列如seq id no:10所示的轻链可变区，和氨基酸序列如seq id no:11所示的重链可变区；或

24、(2)氨基酸序列如seq id no:12所示的轻链可变区，和氨基酸序列如seq id no:11所示的重链可变区；或

25、(3)氨基酸序列如seq id no:13所示的轻链可变区，和氨基酸序列如seq id no:14所示的重链可变区；或

26、(4)氨基酸序列如seq id no:13所示的轻链可变区，和氨基酸序列如seq id no:15所示的重链可变区。

27、在一些方案中，上述抗ctla-4抗体包含：

28、(1)氨基酸序列如seq id no:16所示的轻链氨基酸序列，和氨基酸序列如seq idno:17所示的重链氨基酸序列。

29、(2)氨基酸序列如seq id no:18所示的轻链氨基酸序列，和氨基酸序列如seq idno:19所示的重链氨基酸序列。

30、(3)氨基酸序列如seq id no:20所示的轻链氨基酸序列，和氨基酸序列如seq idno:21所示的重链氨基酸序列。

31、(4)氨基酸序列如seq id no:22所示的轻链氨基酸序列，和氨基酸序列如seq idno:23所示的重链氨基酸序列。

32、在一些方案中，上述药物组合物中抗ctla-4抗体或其抗原结合片段的浓度为约1～100mg/ml，优选为约1～50mg/ml，更优选为约5～30mg/ml；更优选地，上述抗ctla-4抗体或其抗原结合片段浓度为约1mg/ml，5mg/ml，7mg/ml，9mg/ml，10mg/ml，11mg/ml，15mg/ml，20mg/ml，25mg/ml，30mg/ml，40mg/ml，50mg/ml，60mg/ml，70mg/ml，80mg/ml，90mg/ml，100mg/ml或这些范围内任意两个数值作为端点形成的范围，优选为约9mg/ml，10mg/ml，11mg/ml或15mg/ml。

33、在一些方案中，上述药物组合物的ph为约4.5～6.5，优选为约5.0～6.0，更优选为约5.3～5.7，上述药物组合物的ph非限制性实施例为约4.5，5.0，5.1，5.2，5.3，5.4，5.5，5.6，5.7，5.8，5.9，6.0，6.1，6.2，6.3，6.4，6.5或这些范围内任意两个数值作为端点形成的范围，优选为约5.4，5.5或5.6。

34、在一些方案中，上述药物组合物的渗透压为约250～350mosm/kg。

35、在一些方案中，上述缓冲液选自醋酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液和组氨酸缓冲液中的一种或多种；优选地，所述缓冲液为醋酸缓冲液。

36、在一些方案中，上述缓冲液为醋酸缓冲液，优选地，所述醋酸缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液或醋酸-醋酸钾缓冲液，优选为醋酸-醋酸钠缓冲液。

37、在一些方案中，上述醋酸缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液。在一些方案中，醋酸-醋酸钠缓冲液由约1～20mm的醋酸和约1～20mm的醋酸钠制成。在一些方案中，醋酸-醋酸钠缓冲液由摩尔比为约1:2到约1:3的醋酸和醋酸钠制成。在一些方案中，醋酸-醋酸钠缓冲液由摩尔比为约1:5到约1:8的醋酸和醋酸钠制成。在一些方案中，醋酸-醋酸钠缓冲液为：由约6.5mm的醋酸和约13.5mm的醋酸钠制成的ph为约5.0的醋酸缓冲液。在一些方案中，醋酸-醋酸钠缓冲液为：由约2～4mm的醋酸和约16～18mm的醋酸钠制成的ph为约5.0～6.0的醋酸缓冲液；优选为由约3mm的醋酸和约17mm的醋酸钠制成的ph为约5.5的醋酸缓冲液。

38、在一些方案中，上述组氨酸缓冲液选自组氨酸-组氨酸盐酸盐缓冲液或组氨酸-组氨酸醋酸盐缓冲液，优选组氨酸-组氨酸盐酸盐缓冲液。在一些方案中，上述组氨酸-组氨酸盐酸盐缓冲液由组氨酸和组氨酸盐酸盐制成，优选l-组氨酸和l-组氨酸单盐酸盐。在一些方案中，组氨酸缓冲液由约1～20mm的l-组氨酸和约1～20mm的l-组氨酸单盐酸盐制成。在一些方案中，组氨酸缓冲液由摩尔比为约1:1到约1:4的组氨酸和组氨酸盐酸盐制成。在一些方案中，组氨酸缓冲液由摩尔比为约1:1组氨酸和组氨酸盐酸盐制成。在一些方案中，组氨酸缓冲液由摩尔比为约1:3的组氨酸和组氨酸盐酸盐制成。在一些方案中，组氨酸制剂为：由约4.5mm的l-组氨酸和约15.5mm的l-组氨酸单盐酸盐制成的ph为约5.5的组氨酸缓冲剂。在一些方案中，组氨酸制剂为：由约10mm的组氨酸和约10mm的组氨酸盐酸盐制成的ph为约6.0的组氨酸缓冲液。

39、在一些方案中，上述缓冲液为柠檬酸缓冲液，优选地，所述柠檬酸缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。在一些方案中，柠檬酸缓冲液由约1～20mm的柠檬酸和约1～20mm的柠檬酸钠制成。在一些方案中，柠檬酸缓冲液由摩尔比为约1:1到1:4的柠檬酸和柠檬酸钠制成。在一些方案中，柠檬酸缓冲液为：由约5.0mm的柠檬酸和约15.0mm的柠檬酸钠制成的ph为约6.5的柠檬酸缓冲液。在一些方案中，柠檬酸缓冲液为：由约10mm的柠檬酸和约10mm的柠檬酸钠制成的ph为约6.0的柠檬酸缓冲液。

40、在一些方案中，上述缓冲液为磷酸盐缓冲液，优选地，所述磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。在一些方案中，磷酸盐缓冲液由约1～20mm的磷酸氢二钠和约1～20mm的磷酸二氢钠制成。在一些方案中，磷酸盐缓冲液由摩尔比为约1:1到1:4的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠制成。在一些方案中，磷酸盐缓冲液为：由约10mm的磷酸氢二钠和约10mm的磷酸二氢钠制成的ph为约7.0的磷酸盐缓冲液。

41、在一些方案中，上述缓冲液的浓度为约5～100mm，优选为约10～50mm，优选为约10～30mm；优选为约15～25mm，上述缓冲液浓度非限制性实施例为约10mm，15mm，20mm，25mm，30mm，40mm，45mm，50mm或这些范围内任意两个数值作为端点形成的范围，优选为约15mm，20mm或25mm。

42、在一些方案中，上述缓冲液的ph为约4.5～6.5，优选为约5.0～6.0，更优选为约5.3～5.7，上述缓冲液的ph非限制性实施例为约5.0，5.1，5.2，5.3，5.4，5.5，5.6，5.7，5.8，5.9，6.0，6.1，6.2，6.3，6.4，6.5或这些范围内任意两个数值作为端点形成的范围，优选为约5.4，5.5或5.6。在一些方案中，上述的药物组合物还包括稳定剂，所述稳定剂选自精氨酸、精氨酸盐、氯化钠、甘露醇、山梨醇、蔗糖和海藻糖中的一种或多种；优选地，上述精氨酸盐为盐酸精氨酸。在一些方案中，上述稳定剂的浓度为约10～400mm，优选为约100～300mm，优选为约130～280mm，优选为约200～260mm，上述稳定剂浓度非限制性实施例为约130mm，135mm，140mm，150mm，160mm，170mm，180mm，190mm，200mm，210mm，220mm，228mm，230mm，240mm，250mm，260mm或这些范围内任意两个数值作为端点形成的范围，优选为约210mm，220mm，228mm或230mm。

43、在一些方案中，上述稳定剂为浓度约130～280mm的甘露醇；或上述稳定剂为浓度约130～280mm的蔗糖；或上述稳定剂为浓度约20～80mm的氯化钠与浓度约110-170mm的甘露醇的组合；或上述稳定剂为浓度约20～80mm的氯化钠与浓度约110-170mm的蔗糖的组合；在一些方案中，上述稳定剂为浓度约200～260mm的甘露醇；或上述稳定剂为浓度约200～260mm的蔗糖；或上述稳定剂为浓度约30～70mm的氯化钠与浓度约120-160mm的甘露醇的组合；或上述稳定剂为浓度约30～70mm的氯化钠与浓度约120-160mm的蔗糖的组合。

44、在一些方案中，上述稳定剂为甘露醇。在一些方案中，上述稳定剂为浓度约100～300mm的甘露醇，上述甘露醇的浓度优选为约130～280mm，优选为约200～260mm，上述甘露醇浓度的非限制性实施例为约200mm，210mm，220mm，230mm，240mm，250mm，260mm或这些范围内任意两个数值作为端点形成的范围，优选为约240mm。

45、在一些方案中，上述稳定剂为蔗糖。在一些方案中，上述稳定剂为浓度约100～300mm的蔗糖，上述蔗糖的浓度优选为约130～280mm，优选为约200～260mm，上述蔗糖浓度的非限制性实施例为约200mm，210mm，220mm，228mm，230mm，240mm，250mm或这些范围内任意两个数值作为端点形成的范围，优选为约220mm或约228mm。

46、在一些方案中，上述稳定剂为氯化钠与甘露醇的组合。在一些方案中，上述稳定剂为约30～200mm的氯化钠与约30～200mm的甘露醇的组合，优选约20～80mm的氯化钠与约110～170mm的甘露醇的组合，优选约30～70mm的氯化钠与约120～160mm的甘露醇的组合，上述稳定剂的非限制性实施例为约50mm的氯化钠与约140mm的甘露醇的组合，或约50mm的氯化钠与约150mm的甘露醇的组合。

47、在一些方案中，上述稳定剂为氯化钠与蔗糖的组合。在一些方案中，上述稳定剂为约30～200mm的氯化钠与约30～200mm的蔗糖的组合，优选约20～80mm的氯化钠与约110～170mm的蔗糖的组合，优选约30～70mm的氯化钠与约120～160mm的蔗糖的组合，上述稳定剂的非限制性实施例为约50mm的氯化钠与约140mm的蔗糖的组合，或约50mm的氯化钠与约160mm的蔗糖的组合。

48、在一些方案中，上述药物组合物还包括表面活性剂，所述表面活性剂选自聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20和泊洛沙姆188中的一种或多种。

49、在一些方案中，上述表面活性剂选自聚山梨醇酯80。

50、在一些方案中，上述表面活性剂选自聚山梨醇酯20。

51、在一些方案中，以w/v计算，上述表面活性剂浓度为约0.001％～0.1％，优选为约0.01％～0.1％，优选为约0.01％～0.05％；作为非限制性实施例，上述表面活性剂的浓度为约0.01％，0.02％，0.03％，0.04％，0.08％或这些范围内任意两个数值作为端点形成的范围，优选为约0.02％。

52、在一些方案中，药物组合物包含如下(1)～(13)中任一项所示的组分，或分别由(1)～(13)任一项所示的组分组成：

53、(1)(a)约1～50mg/ml的上述抗ctla-4抗体或其抗原结合片段；(b)约10～30mm醋酸缓冲液，ph为约5.0～6.0；(c)130～280mm的甘露醇；以及(d)约0.01％～0.1％(w/v)的聚山梨醇酯80；或

54、(2)(a)约1～50mg/ml的上述抗ctla-4抗体或其抗原结合片段；(b)约10～30mm醋酸缓冲液，ph为约5.0～6.0；(c)130～280mm的蔗糖；以及(d)约0.01％～0.1％(w/v)的聚山梨醇酯80；或

55、(3)(a)约1～50mg/ml的上述抗ctla-4抗体或其抗原结合片段；(b)约10～30mm醋酸缓冲液，ph为约5.0～6.0；(c)稳定剂，所述稳定剂为浓度约20～80mm的氯化钠与浓度约110-170mm的甘露醇的组合；以及(d)约0.01％～0.1％(w/v)的聚山梨醇酯80；或

56、(4)(a)约1～50mg/ml的上述抗ctla-4抗体或其抗原结合片段；(b)约10～30mm醋酸缓冲液，ph为约5.0～6.0；(c)稳定剂，所述稳定剂为浓度约20～80mm的氯化钠与浓度约110-170mm的蔗糖的组合；以及(d)约0.01％～0.1％(w/v)的聚山梨醇酯80；或

57、(5)(a)约5～30mg/ml的上述抗ctla-4抗体或其抗原结合片段；(b)约10～30mm醋酸缓冲液，ph为约5.0～6.0；(c)200～260mm的甘露醇；以及(d)约0.01％～0.05％(w/v)的聚山梨醇酯80；或

58、(6)(a)约5～30mg/ml的上述抗ctla-4抗体或其抗原结合片段；(b)约10～30mm醋酸缓冲液，ph为约5.0～6.0；(c)200～260mm的蔗糖；以及(d)约0.01％～0.05％(w/v)的聚山梨醇酯80；或

59、(7)(a)约5～30mg/ml的上述抗ctla-4抗体或其抗原结合片段；(b)约10～30mm醋酸缓冲液，ph为约5.0～6.0；(c)稳定剂，所述稳定剂为浓度约30～70mm的氯化钠与浓度约120-160mm的甘露醇的组合；以及(d)约0.01％～0.05％(w/v)的聚山梨醇酯80；或

60、(8)(a)约5～30mg/ml的上述抗ctla-4抗体或其抗原结合片段；(b)约10～30mm醋酸缓冲液，ph为约5.0～6.0；(c)稳定剂，所述稳定剂为浓度约30～70mm的氯化钠与浓度约120-160mm的蔗糖的组合；以及(d)约0.01％～0.05％(w/v)的聚山梨醇酯80；或

61、(9)(a)约10mg/ml的抗ctla-4抗体，所述抗ctla-4抗体包含如seq idno:16所示的轻链氨基酸序列和如seq id no:17所示的重链氨基酸序列；(b)约20mm醋酸缓冲液，ph为约5.5；(c)约240mm的甘露醇；以及(d)约0.02％(w/v)的聚山梨醇酯80；或

62、(10)(a)约10mg/ml的抗ctla-4抗体，所述抗ctla-4抗体包含如seq id no:16所示的轻链氨基酸序列和如seq id no:17所示的重链氨基酸序列；(b)约20mm醋酸缓冲液，ph为约5.5；(c)约220mm的蔗糖；以及(d)约0.02％(w/v)的聚山梨醇酯80；或

63、(11)(a)约10mg/ml的抗ctla-4抗体，所述抗ctla-4抗体包含如seq id no:16所示的轻链氨基酸序列和如seq id no:17所示的重链氨基酸序列；(b)约20mm醋酸缓冲液，ph为约5.5；(c)约228mm的蔗糖；以及(d)约0.02％(w/v)的聚山梨醇酯80；或

64、(12)(a)约10mg/ml的抗ctla-4抗体，所述抗ctla-4抗体包含如seq id no:16所示的轻链氨基酸序列和如seq id no:17所示的重链氨基酸序列；(b)约20mm醋酸缓冲液，ph为约5.5；(c)稳定剂，所述稳定剂为浓度约50mm的氯化钠与浓度约140mm的甘露醇的组合；以及(d)约0.02％(w/v)的聚山梨醇酯80；或

65、(13)(a)约10mg/ml的抗ctla-4抗体，所述抗ctla-4抗体包含如seq id no:16所示的轻链氨基酸序列和如seq id no:17所示的重链氨基酸序列；(b)约20mm醋酸缓冲液，ph为约5.5；(c)稳定剂，所述稳定剂为浓度约50mm的氯化钠与浓度约140mm的蔗糖的组合；以及(d)约0.02％(w/v)的聚山梨醇酯80。

66、在一些方案中，本文任一项方案中所述的药物组合物为液体制剂或冻干制剂。

67、在一些方案中，上述药物组合物为液体制剂。

68、在一些方案中，上述液体制剂或冻干制剂于2～8℃稳定至少3个月，至少6个月，至少12个月，至少18个月或至少24个月。

69、在一些方案中，上述液体制剂或冻干制剂于40℃稳定至少7天，至少14天或至少28天。

70、本发明还提供了一种注射剂，其含有本文任一项方案中所述的药物组合物与氯化钠溶液或葡萄糖溶液；优选地，所述氯化钠溶液浓度为约0.85～0.9％(w/v)；优选地，所述葡萄糖溶液浓度为约5～25％(w/v)，更优选为约5～10％(w/v)；优选地，所述注射剂中，所述抗ctla-4抗体的浓度为约0.05～10.5mg/ml，更优选为约0.1～5mg/ml或约1～5mg/ml；所述注射剂的ph为约4.5～6.5，优选为约5.0～6.0，更优选为约5.3～5.7。

71、在一些方案中，上述药物组合物或注射剂，其经静脉注射施用。

72、本发明还提供了本文任一项方案中所述的药物组合物或注射剂在制备用于治疗和/或预防ctla-4介导的疾病或病症的药物中的用途。

73、本发明还提供了本文任一项方案中所述的药物组合物或注射剂，其用于治疗和/或预防ctla-4介导的疾病或病症。

74、本发明还提供了一种治疗和/或预防ctla-4介导的疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用如本文任一项方案中所述的药物组合物或注射剂。

75、在一些方案中，上述疾病或病症为癌症。