一种醛缩酶生物元件筛选方法的构建与应用

本发明属于生物，涉及利用生物催化剂醛缩酶以及醛缩酶催化甲醛与丙酮酸缩合生成4-羟基-2-酮丁酸化合物。

背景技术：

1、甲醛是一种重要的一碳化合物代谢中间体。甲醇、甲烷等一碳化合物均可以经过酶催化反应转化为甲醛，进一步可进入中心代谢途径、合成生物质，用于微生物体的生长以及高附加值化学品的合成(engineering the bioconversion of methane and methanolto fuels and chemicalsinnativeand synthetic methylotrophs,r kyle bennett,lisam steinberg,wilfred chen,eleftherios t papoutsakis.curr.opin.biotechnol.2018.50:81-93；current advance in bioconversion of methanol to chemicals，wenmingzhang,meng song,qiao yang,zhongxue dai,shangjie zhang,fengxue xin,weiliangdong,jiangfeng ma,min jiang.biotechnol.biofuels.2018.11,:11.)。天然甲醛利用途径主要包括三种：1)核酮糖单磷酸途径(rump，ribulose monophosphate pathway)；2)卡尔文循环(cbb，calvin benson bassham pathway)；3)丝氨酸途径(serine pathway)。在甲醛天然利用途径中，研究最多和最有效的甲醛利用途径是rump途径，目前已有文献报道在工程菌株中利用rump途径以甲醇为碳源维持微生物体生长(engineering escherichia colifor methanol conversion,jonas e n müller,fabian meyer,boris litsanov,patrickkiefer,eva potthoff,stéphanie heux,wim j quax,volker f wendisch,trygvebrautaset,jean-charles portais,julia a vorholt.metab.eng.2015.28:190-201；improving formaldehyde consumption drives methanol assimilation in engineerede.coli.,benjamin m.woolston,jason r.king,michael reiter,bob van hove&gregorystephanopoulos.nat.commun.2018.9：2387)或生产高附加值化学品(engineering thebiological conversion of methanol to specialty chemicals in escherichia coli,w.brianwhitaker,j.andrewjones,r.kylebennett,jacqueline e.gonzalez,victoriar.vernacchio,shannon m.collins,michael a.palmer,samuelschmidt,maciekr.antoniewicz,mattheosa.koffas,eleftheriost.papoutsakis.metab.eng.2017.39:49-59)。但同样rump途径也存在着不足，其中最关键的一点就是rump途径大大受限于ru5p受体低效率的再生。从而限制了甲醇和甲醛等一碳化合物在微生物体内的利用(biologicalconversion of methane to chemicals and fuels:technical challenges and issues,in yeub hwang,anh duc nguyen,thu thi nguyen,linh thanh nguyen,ok kyung lee,eun yeol lee.microbiol.biotechnot.2018.102.3071-3080)。

2、由于甲醛的高反应活性，它可以和多种含酮基的中间代谢物反应，从而合成高级代谢产物。酮基是微生物体内代谢产物最为常见的功能基团之一，甲醛引发的醛缩反应为甲醛、甲醇等一碳利用提供了新的研究思路。目前已有文献报道甲醛非天然利用途径，本发明人尤其注意到甲醛利用新途径：非天然高丝氨酸循环(homoserine cycle)途径(anoptimized methanol assimilation pathway relying on promiscuous formaldehyde-condensing aldolases in e.coli,haihe,philippemarlière,arrenbar-even.metabeng,2020.60:1-13)。在该途径中，甲醛可以和糖酵解终端产物丙酮酸进行非天然醛缩反应生成4-羟基2-酮丁酸。4-羟基2-酮丁酸是生物制造中的一种重要中间体，可进一步合成多种高附加值化学品，包括高丝氨酸、3-羟基丙酸，1,3-丙二醇等(combining aldolases and transaminases for the synthesis of 2-amino-4-hydroxybutanoic acid,karel hernandez,jordibujons,jesus joglar,simonj.charnock,pablo domínguez de maría,wolf dieter fessner,andpereclapes.acscatal,2017.7(3):1707-1711；an aldolase-catalyzed new metabolicpathway for the assimilation of formaldehyde and methanol to synthesize2-keto-4-hydroxybutyrate and 1,3-propanediol in escherichia coli,chuang wang,jie ren,libang zhou,zhidong li,lin chen,an-ping zeng.acs synth.biol.2019.8：2483-2493)。相较于天然利用途径，甲醛非天然利用途径具有简短、高效优势，因此成为甲醇、甲烷、甲醛等微生物一碳利用的研究热点方向。

3、在一碳利用方面，甲醛和丙酮酸的非天然缩合反应，已展现出极大的应用潜力。但目前报道的能够有效催化甲醛与丙酮酸缩合反应的醛缩酶非常少，主要包括2-酮-4-羟基戊二酸醛缩酶(khb，ec 4.1.3.16)，2-脱氢-3-脱氧-l-鼠李糖酸醛缩酶(rhma,也命名为yfau,ec 4.1.2.53)和5-酮-4脱氧-d-戊二酸醛缩酶(garl,ec 4.1.2.20)等。同时已报道的醛缩酶普遍对甲醛亲和力不高，表现出较低的催化活性，因此限制了甲醛非天然利用途径的应用。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明将提供一种高效挖掘、筛选醛缩生物材料的方法策略，成功筛选了一些列能够有效催化甲醛与丙酮酸缩合生成4-羟基-2-酮丁酸的新型醛缩酶。为解决甲醛利用奠定酶元件基础。

2、本发明的一个目的提供一种醛缩酶生物元件的应用，所述应用是以丙酮酸与甲醛为底物，生物合成4-羟基-2-酮丁酸以及4-羟基-2-酮丁酸下游衍生物，其中所述醛缩酶能够以甲醛与丙酮酸为底物，生物合成4-羟基-2-酮丁酸；所述醛缩酶生物元件为如下b1或b2或b3：

3、b1、醛缩酶，b2、编码所述醛缩酶的核酸序列，b3、含有所述核酸序列的表达盒、重组载体或重组微生物；

4、所述醛缩酶为如下c1-c12任一种：

5、c1、序列表中序列1所示的蛋白；

6、c2、序列表中序列2所示的蛋白；

7、c3、序列表中序列3所示的蛋白；

8、c4、序列表中序列4所示的蛋白；

9、c5、序列表中序列5所示的蛋白；

10、c6、序列表中序列6所示的蛋白；

11、c7、序列表中序列7所示的蛋白；

12、c8、序列表中序列8所示的蛋白；

13、c9、序列表中序列9所示的蛋白；

14、c10、序列表中序列10所示的蛋白；

15、c11、将c1-c10任一所述蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到具有相同功能的蛋白质；

16、c12、c1-c10任一所述蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白；

17、将上述c12中的标签用于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化等。蛋白标签是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白。

18、所述标签可为下表中所示的标签中的任一：

19、表1融合表达蛋白标签

20、 标签 残基 序列 poly-his 2-10(通常为6个) hhhhhh poly-arg 5-6个(通常为5个) rrrrr flag 8 dykddddk c-myc 10 eqkliseedl strep-tag ii 8 wshpqfek mbp 367 序列10

21、上述用醛缩生物材料催化甲醛与丙酮酸缩合生成4-羟基-2-酮丁酸应用中(相应也提供了一种4-羟基-2-酮丁酸或4-羟基-2-酮丁酸下游衍生物的制备方法)；

22、进一步的，b3所述的核酸分子的表达盒是指能够在宿主细胞中表达上述醛缩酶dna，该dna不但可包括启动醛缩酶编码基因转录的启动子，还可包括醛缩酶编码基因转录的终止子。更进一步的，所述表达盒还可包括增强子序列。

23、b3所述的核酸分子的重组载体可为携带有所述醛缩酶编码基因的细菌质粒(如在细菌中表达的基于t7启动子的表达载体，具体如pet-16b、pet28a等；在细菌中表达的基于trc启动子的表达载体，具体如ptrc99a、ptrc33a等)、噬菌体、酵母质粒或逆转录病毒包装质粒。

24、b3所述的含有编码上述脱氢酶的核酸分子的重组微生物可为携带有所述醛缩酶编码基因的细菌、酵母、藻或真菌，如大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌、甲基营养菌等。

25、其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。

26、在上述应用中，所述醛缩酶以粗酶液、粗酶液冻干粉、全细胞或纯酶的形式发生催化作用。进一步，所述粗酶液、粗酶液冻干粉和纯酶具体可按照包括如下步骤的方法制备得到：在宿主细胞中表达所述醛缩酶，得到重组细胞；裂解所述重组细胞获得所述粗酶液、粗酶液冻干粉或纯酶。所述全细胞可按照包括如下步骤的方法制备得到：在宿主细胞中表达所述醛缩酶，得到的重组细胞即为所述全细胞。

27、再进一步，所述重组细胞具体可按照包括如下步骤的方法制备获得：向所述宿主细胞导入能够表达所述醛缩酶的核酸分子，经诱导培养后获得表达所述醛缩酶的所述重组细胞。

28、更进一步，所述“能够表达所述醛缩酶的核酸分子”是通过重组载体的形式导入到所述宿主细胞中的。其中，所述重组载体可为携带有醛缩酶的编码基因的细菌质粒(如在细菌中表达的基于t7启动子的表达载体，具体如pet-16b等,或在细菌中表达的基于trc启动子的表达载体，具体如ptrc99a等)、噬菌体、酵母质粒或逆转录病毒包装质粒。

29、更进一步的，所述醛缩酶的编码基因是通过重组载体的形式导入到所述宿主细胞中的。其中，所述重组载体可为携带有所述醛缩酶的编码基因的细菌质粒(如在细菌中表达的基于t7启动子的表达载体，具体如pet-16b等,或在细菌中表达的基于trc启动子的表达载体，具体如ptrc99a等)、噬菌体、酵母质粒或逆转录病毒包装质粒。

30、在本发明的一个实施例中，选用的宿主细胞为大肠杆菌(escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamnicum)、谷草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、乳酸菌(lactic acid bacteria)、恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)、甲基营养菌(methylorubrumextorquens)、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)等微生物细胞。优选大肠杆菌，更优选的是大肠杆菌w3110。

31、本发明的一种实施方式中，甲醇脱氢酶、醛缩酶以质粒ptrc99a为表达载体进行共表达。

32、本发明的一种实施方式中，肌氨酸氧化酶、醛缩酶以质粒ptrc99a为表达载体进行共表达。

33、本发明进一步提供上述基因工程重组菌株在生产4-羟基-2-酮丁酸的方法。

34、在本发明的一种实施方式中，采用本发明所述的重组菌以甲醇或肌氨酸为底物生产4-羟基-2-酮丁酸的方法如下：

35、1)种子培养：

36、根据质粒抗性向lb培养基添加羧苄霉素(50μg/ml)，挑取单克隆接种至含lb培养基试管，37℃，220r/min过夜培养；

37、2)发酵培养：

38、过夜培养获得种子液，以初始od600＝0.1转接无机盐培养基，同时添加羧苄霉素(50μg/ml)，葡萄糖浓度为10g/l，37℃条件下，220rpm培养,待菌体od600＝0.5时，添加0.1mm iptg诱导基因表达，诱导3h后添加底物甲醇10g/l或者肌氨酸10mm,30℃条件下继续培养24h。

39、在一个实验中，结果表明添加10mm肌氨酸可生成5.33mm的4-羟基-2-酮丁酸，添加10g/l甲醇可生成0.95mm的4-羟基-2-酮丁酸。

40、本发明由此提供一种筛选能够应用于有效催化甲醛与丙酮酸缩合生成4-羟基-2-酮丁酸的醛缩酶的方法，包括如下步骤：

41、(1)筛选出满足以下特征的候选醛缩酶：

42、a1)属于hpch功能域家族蛋白；

43、a2)数据库功能注释为可催化乙醛与丙酮酸缩合的4-羟基-2-氧代戊酸醛缩酶；

44、a3)氨基酸序列长度范围为240-320个氨基酸；

45、a4)能够以甲醛与丙酮酸为底物，在适当的条件和介质内进行酶催化反应，生物合成4-羟基-2-酮丁酸；

46、(2)验证所述候选醛缩酶的功能，具体地以丙酮酸与甲醛为底物，以候选醛缩酶作为催化酶，验证是否能够催化生成4-羟基-2-酮丁酸或其催化效率。

47、本发明提供了一种高效筛选可催化甲醛与丙酮酸缩合反应醛缩酶的有效策略，并成功筛选了一系列可高效催化甲醛与丙酮酸缩合反应生成4-羟基-2-酮丁酸的醛缩酶，这些醛缩酶催化该反应为首次发现，为甲醇、甲烷、甲醛、甲酸、二氧化碳等微生物一碳利用以及发展奠定了良好的筛选策略以及高效酶元件基础。