通用型多功能植物表达载体及其构建方法和应用

本发明涉及植物基因工程与分子生物学，具体涉及一种通用型多功能植物表达载体及其构建方法和应用。

背景技术：

1、植物基因工程技术克服了植物有性杂交的限制，通过将外源基因导入植物来改良植物性状，培育优质高产作物新品种，为植物的遗传改良开拓了广阔的前景。在基因克隆、基因功能分析以及基因转化等分子生物学的研究与应用过程中，载体构建是常用的技术手段，采用适当的表达载体及构建方法则会取得事半功倍的效果。尽管目前已公开了多种植物表达载体，但对于通用型多功能植物表达载体的开发仍相对缓慢，还不能满足转基因产业化不断扩大的需求。

2、双分子荧光互补技术(bifc)是将荧光蛋白在合适的位点截断，分别构建于两个表达载体中，再借助融合于其上的目标蛋白间的相互作用，彼此靠近，重新形成完整的具有活性的荧光蛋白，从而表征出蛋白间的相互作用，并指示出其在细胞中的相互作用位点。bifc技术简单直观，可视性强，被广泛应用于植物体内或体外蛋白质相互作用的检测。现有植物bifc技术中的表达载体功能单一，检测效率低下，因此需要开发更高效的多功能植物表达载体，以提高检测效率和准确度。

3、在真核细胞中，亚细胞定位是了解目标蛋白在细胞中参与生理过程的重要手段，为系统地理解蛋白质的作用机制提供研究方向。细胞器荧光标记系能精确指示出目标蛋白的具体位置，在植物亚细胞定位中发挥重要作用。然而，目前对于植物细胞器荧光标记系的开发仍相对缓慢，迫切需要开发新型细胞器荧光标记系，以弥补现有技术中存在的问题及缺陷。

4、综上所述，开发通用型多功能植物表达载体，不仅有助于提升实验效率、提高检测精度，也有助于植物基因功能的挖掘，在植物基因工程与分子生物学领域中具有很好的应用前景。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种通用型多功能植物表达载体及其构建方法和应用，以有效提升实验效率，提高检测精度，为植物遗传转化、蛋白质亚细胞定位及蛋白质相互作用分析提供有力的工具。

2、为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

3、本发明提供了一种通用型多功能植物表达载体,包括通用型多功能植物表达载体prc1.4和/或通用型多功能植物表达载体prc1.24，所述通用型多功能植物表达载体prc1.4为pri201-an进行hindiii和avrii双酶切，保留含有t-dna片段rb端侧翼序列、大肠杆菌和农杆菌的复制起点及其nptiii选择标记基因序列的线性载体骨架与含有t-dna片段lb端侧翼序列的人工合成片段rc1.4进行无缝连接，重组而成的环状载体，所述rc1.4由atubq10pro-mcs-3xflag-linker-nyfp-hspt基因表达盒、atactin11pro-ath2b-mrfp1-nost基因表达盒、nospro-hyg-nost基因表达盒依次串联，并在串联序列5’端和3’端分别添加含有15bp与pri201-an线性骨架特异性重组的接头序列的hindiii和avrii酶切位点而成；其中，atubq10pro-mcs-3xflag-linker-nyfp-hspt基因表达盒由拟南芥启动子atubq10pro、带有kpni和bamhi特异性酶切位点的多克隆位点mcs、多肽标签3xflag、连接肽linker ggggsggggsggggs编码序列、荧光蛋白yfp的n端nyfp序列以及热激蛋白终止子hspt依次连接组成，atactin11pro-ath2b-mrfp1-nost基因表达盒由拟南芥启动子atactin11pro、拟南芥组蛋白ath2b编码框、红色荧光标签mrfp1及胭脂碱合成酶终止子nost依次连接组成，nospro-hyg-nost基因表达盒由胭脂碱合成酶基因启动子nospro、潮霉素抗性标记hyg编码框及胭脂碱合成酶终止子nost依次连接组成；所述通用型多功能植物表达载体prc1.24为pri201-an进行hindiii和avrii双酶切，保留含有t-dna片段rb端侧翼序列、大肠杆菌和农杆菌的复制起点及其nptiii选择标记基因序列的线性载体骨架与含有t-dna片段lb端侧翼序列的人工合成片段rc1.24进行无缝连接，重组而成的环状载体，所述rc1.24由atubq10pro-mcs-4xmyc-linker-cyfp-hspt基因表达盒、atactin11pro-ath2b-tagbfp-nost基因表达盒、nospro-nptii-nost基因表达盒依次串联，并在串联序列5’端和3’端分别添加含有15bp与pri201-an线性骨架特异性重组的接头序列的hindiii和avrii酶切位点而成，其中，atubq10pro-mcs-4xmyc-linker-cyfp-hspt基因表达盒由拟南芥启动子atubq10pro、带有kpni和bamhi特异性酶切位点的多克隆位点mcs、多肽标签4xmyc、连接肽linker ggggsggggsggggs编码序列、荧光蛋白yfp的c端cyfp序列以及热激蛋白终止子hspt依次连接组成，atactin11pro-ath2b-tagbfp-nost基因表达盒由南芥启动子atactin11pro、拟南芥组蛋白ath2b编码框、蓝色荧光标签tagbfp及胭脂碱合成酶终止子nost依次连接组成，nospro-nptii-nost基因表达盒由胭脂碱合成酶基因启动子nospro、卡那霉素抗性标记nptii编码框及胭脂碱合成酶终止子nost依次连接组成。

4、优选地，所述rc1.4的核苷酸序列如seq id no.1所示，rc1.24的核苷酸序列如seqidno.5所示。

5、优选地，所述通用型多功能植物表达载体prc1.4的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述通用型多功能植物表达载体prc1.24的核苷酸序列如seq id no.6所示。

6、本发明还提供了上述通用型多功能植物表达载体的构建方法，其中，通用型多功能植物表达载体prc1.4的构建方法包括如下：

7、对pri201-an进行hindiii和avrii双酶切，保留含有t-dna片段rb端侧翼序列、大肠杆菌和农杆菌的复制起点及其nptiii选择标记基因序列的线性载体骨架；

8、用重组酶将所述线性载体骨架与含有t-dna片段lb端侧翼序列的人工合成片段rc1.4进行无缝连接，重组为环状载体；

9、转化大肠杆菌，测序确定阳性克隆，获得通用型多功能植物表达载体prc1.4；

10、其中，所述rc1.4由atubq10pro-mcs-3xflag-linker-nyfp-hspt基因表达盒、atactin11pro-ath2b-mrfp1-nost基因表达盒、nospro-hyg-nost基因表达盒依次串联，并在串联序列5’端和3’端分别添加含有15bp与pri201-an线性骨架特异性重组的接头序列的hindiii和avrii酶切位点而成；其中，atubq10pro-mcs-3xflag-linker-nyfp-hspt基因表达盒由拟南芥启动子atubq10pro、带有kpni和bamhi特异性酶切位点的多克隆位点mcs、多肽标签3xflag、连接肽linker ggggsggggsggggs编码序列、荧光蛋白yfp的n端nyfp序列以及热激蛋白终止子hspt依次连接组成，atactin11pro-ath2b-mrfp1-nost基因表达盒由拟南芥启动子atactin11pro、拟南芥组蛋白ath2b编码框、红色荧光标签mrfp1及胭脂碱合成酶终止子nost依次连接组成，nospro-hyg-nost基因表达盒由胭脂碱合成酶基因启动子nospro、潮霉素抗性标记hyg编码框及胭脂碱合成酶终止子nost依次连接组成。

11、其中，通用型多功能植物表达载体prc1.24的构建方法包括如下：

12、对pri201-an进行hindiii和avrii双酶切，保留含有t-dna片段rb端侧翼序列、大肠杆菌和农杆菌的复制起点及其nptiii选择标记基因序列的线性载体骨架；

13、用重组酶将所述线性载体骨架与含有t-dna片段lb端侧翼序列的人工合成片段rc1.24进行无缝连接，重组为环状载体；

14、转化大肠杆菌，测序确定阳性克隆，获得通用型多功能植物表达载体prc1.24；

15、其中，所述rc1.24由atubq10pro-mcs-4xmyc-linker-cyfp-hspt基因表达盒、atactin11pro-ath2b-tagbfp-nost基因表达盒、nospro-nptii-nost基因表达盒依次串联，并在串联序列5’端和3’端分别添加含有15bp与pri201-an线性骨架特异性重组的接头序列的hindiii和avrii酶切位点而成，其中，atubq10pro-mcs-4xmyc-linker-cyfp-hspt基因表达盒由拟南芥启动子atubq10pro、带有kpni和bamhi特异性酶切位点的多克隆位点mcs、多肽标签4xmyc、连接肽linker ggggsggggsggggs编码序列、荧光蛋白yfp的c端cyfp序列以及热激蛋白终止子hspt依次连接组成，atactin11pro-ath2b-tagbfp-nost基因表达盒由南芥启动子atactin11pro、拟南芥组蛋白ath2b编码框、蓝色荧光标签tagbfp及胭脂碱合成酶终止子nost依次连接组成，nospro-nptii-nost基因表达盒由胭脂碱合成酶基因启动子nospro、卡那霉素抗性标记nptii编码框及胭脂碱合成酶终止子nost依次连接组成。

16、优选地，rc1.4的核苷酸序列如seq id no.1所示，rc1.24的核苷酸序列如seq idno.5所示。

17、优选地，prc1.4的pcr通用检测引物：正向引物和反向引物序列分别如seq idno.3和seq id no.4所示，prc1.24的pcr通用检测引物：正向引物和反向引物序列分别如seq id no.3和seq id no.7所示。

18、本发明还提供了上述通用型多功能植物表达载体prc1.4和prc1.24的质粒。

19、本发明还提供了含有上述通用型多功能植物表达载体prc1.4或prc1.24的重组菌，具体为含有prc1.4或prc1.24的大肠杆菌和农杆菌。

20、本发明还提供了上述通用型多功能植物表达载体prc1.4和prc1.24、上述通用型多功能植物表达载体prc1.4和prc1.24的质粒、含有上述通用型多功能植物表达载体prc1.4或prc1.24的重组菌应用于外源目的基因在双子叶植物中的稳定超量表达、双分子荧光互补(bifc)、免疫共沉淀(co-ip)和蛋白质亚细胞定位中的应用。既可用于植物细胞的瞬时转化，也可用于植物转基因研究，在双子叶植物中通用。其中，双子叶植物优选为烟草和拟南芥。

21、本发明的有益效果在于：

22、(1)本发明首次在植物bifc载体上添加特异性细胞核荧光探针，即在prc1.4载体包含完整的atactin11pro-ath2b-mrfp1-nost基因表达盒，转化细胞后可通过细胞核有无红色荧光信号来快速检测出阳性细胞系，在prc1.24载体包含完整的atactin11pro-ath2b-tagbfp-nost基因表达盒，转化细胞后可通过细胞核有无蓝色荧光信号来快速检测出阳性细胞系，并且将prc1.4和prc1.24载体用于植物bifc实验时，同时观察上述两种荧光探针，可有效减少假阴性或假阳性结果。

23、(2)本发明提供的prc1.4和prc1.24载体分别包含了不同抗性基因的基因表达盒，有助于快速筛选出prc1.4和prc1.24共转化阳性转化子，有效提高筛选效率。

24、(3)本发明提供的prc1.4和prc1.24载体分别带有不同的特异性细胞核荧光标记，因此可作为核蛋白亚细胞定位的细胞核荧光探针，若需要使用其他细胞器特异性荧光标记，可通过spei酶切位点实现无缝替换；并且在prc1.4和prc1.24载体多克隆位点mcs后分别添加了完整的多肽标签3xflag和4xmyc，因此还可用于植物免疫共沉淀(co-ip)实验，应用广泛，通用性强。