一种用于富集细胞外囊泡的双功能杂化整体材料及其制备方法和应用

本发明属于杂化整体材料领域，具体涉及一种用于富集细胞外囊泡的双功能杂化整体材料及其制备方法和应用。

背景技术：

1、细胞外囊泡(evs)是尺寸在50至1000nm范围内的纳米囊泡，它们由几乎所有类型的细胞分泌，并存在于多种体液中，包括血液、母乳、唾液、尿液和腹水。evs包含多种重要的内容物，涉及脂质、蛋白质、rna和代谢物等，是细胞间通讯的重要媒介。有研究表明，evs中携带的特殊的内容物，如蛋白质和mirna等，与大多数人类恶性肿瘤的发病机理密切相关，所以evs可以作为疾病诊断、预后和治疗的生物标志物。

2、从生物样本中分离出细胞外囊泡(evs)的方法包括基于超速离心(uc)、免疫亲和、聚合物共沉淀、尺寸排阻(sec)及微流控等原理的提取方法。但是，以上方法都有不可避免的局限性，如耗时低效、步骤繁琐、纯度低以及易造成evs的物理性结构损伤等。基于材料的捕获方法可以快速高效地捕获生物样本中的evs，因此受到了越来越多的关注。常用于富集evs的材料主要包括纳米颗粒、聚合物微球以及磁性微球。纳米材料例如二氧化钛、磁性材料和金属-有机框架(mof)纳米颗粒等均在evs富集中表现出优异的富集能力，但是这些材料在制备过程中需要通过表面改性引入特定官能团，操作步骤繁琐。聚合物整体材料也是一种优越的富集材料，具有制备简单、通透性好和ph耐受范围宽等优点，但是相对较低的比表面积，较少的作用位点限制了其在复杂体系中的应用。因此，发展一种制备方法简单，且具有高比表面积、多作用位点的整体材料仍然吸引着人们的目光。

3、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(dspe)是一种具有两条酰基脂链尾的常用于脂质体合成的c18磷脂，能够自发地插入evs的膜结构中，dspe聚乙二醇(peg)化可以显著提高其稳定性，在peg末端加上一个活性官能团，即得到dspe-peg-活性官能团，利用该官能团可介导对其他材料的dspe修饰。dspe的两条酰基脂链尾可以通过非共价键作用力嵌插入磷脂双分子层中，因此经过dspe修饰的材料在生物标志物富集领域有潜在的价值。同时金属离子亲和色谱(immobilizedmetalaffinitychromatography，imac)技术是通过带正电荷的金属离子与磷脂膜中磷酸基团的螯合作用和离子相互作用而特异性地富集和分离evs。

技术实现思路

1、随着对杂化整体材料的深入研究，发现通过对杂化整体材料进行dspe和金属离子亲和(imac)功能化，可以实现高效的细胞外囊泡富集效果。现有技术中都存在着有不可避免的局限性，如耗时低效、步骤繁琐、纯度低以及易造成evs的物理性结构损伤等问题。

2、为了解决上述现有的技术问题，降低开发成本，提高分离技术效率，本发明提供一种用于富集细胞外囊泡的双功能杂化整体材料的制备方法，包括如下步骤：

3、s11：将二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-活性基团、带有活性基团的硅烷化试剂和有机溶剂混合后反应，得到dspe-peg-硅烷化试剂；所述带有活性基团的硅烷化试剂为γ-环氧丙氧丙基三甲氧基硅烷(gptms)、氨丙基三甲氧基硅烷或乙烯基三甲基硅烷；

4、s12：将所述dspe-peg-硅烷化试剂、四甲氧基硅烷(teos)、二乙基磷酰乙基三乙氧基硅烷(dpts)、十二胺、十六烷基溴化铵(ctab)、水和乙醇混合后反应，除杂，得到双功能化的杂化整体材料；

5、s13：将所述双功能化的杂化整体材料和钛盐水溶液混合后孵育，除去游离ti4+，得到所述用于富集细胞外囊泡的双功能杂化整体材料。

6、以dspe-peg-活性基团和带有活性基团的硅烷化试剂为原料，首先制备末端带有活性官能团的dspe-peg-硅烷化试剂，然后将teos、dspe-peg-硅烷化试剂、dpts、ctab、十二胺以及溶剂乙醇和水混合均匀，通过溶胶-凝胶法得到表面带有dspe和磷脂基团的双功能杂化整体材料。在该反应体系中，表面活性剂ctab促进硅烷化试剂在体系中均匀分散，十二胺以及溶剂乙醇和水共同对整体材料的孔道结构进行调节，以增大整体材料的比表面积，进而获得更多的作用位点。最后通过磷脂官能团与金属离子进行螯合，即可得到具有dspe和金属离子亲和(imac)功能的杂化整体材料。

7、所制备的杂化整体材料能够从生物样本(细胞培液、尿液、血浆、唾液、脑脊液等)中高效快速地富集细胞外囊泡(evs)。整体材料表面的金属离子与evs中的磷酸基团具有金属亲和作用力，并且整体材料所含的dspe链可以插入evs的磷脂双分子层中，通过非共价键结合evs，从而实现evs的高效富集。而且材料较大的比表面积可以为富集过程提供较多的作用位点，以实现高效的evs富集。此外，以弱碱洗脱的方式可以实现evs的快速分离，并且evs的生物学功能完整，这为evs高效可靠的分离提供了技术支持。

8、所述制备方法中的合成及修饰过程操作简单，原料成本低，反应条件温和并且迅速，操作简单易行，对环境友好。

9、优选的，所述二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-活性基团为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-巯基或二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基。所述二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-活性基团均购买自西宝生物科技股份有限公司。

10、进一步地，所述二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-活性基团和带有活性基团的硅烷化试剂的摩尔比为1：1-2。

11、优选的，所述步骤s11中，反应的温度为35-50℃，反应的时间为2-6h。

12、优选的，所述步骤s11中，有机溶剂为甲醇或乙醇。

13、优选的，所述步骤s12中，dspe-peg-硅烷化试剂、四甲氧基硅烷、二乙基磷酰乙基三乙氧基硅烷中si的总量和十二胺的摩尔比为1-5：0.01-0.05。

14、优选的，所述步骤s12中，十二胺、十六烷基溴化铵、水和乙醇的摩尔比为0.01-0.05：0.01-0.04：10-25：3-8。

15、优选的，所述步骤s12中，混合的方法为超声混合。

16、优选的，所述步骤s12中，除杂的方法为乙醇和水冲洗后干燥。

17、优选的，所述步骤s12中，反应的温度为35-50℃。

18、优选的，所述步骤s13中，钛盐水溶液为硫酸钛水溶液。

19、进一步地，所述硫酸钛水溶液的浓度为60-150mg/ml。

20、优选的，所述步骤s13中，孵育的时间为5-24h。

21、本发明分三个过程进行，首先是合成了尾端为硅烷化基团的peg-dspe分子，然后通过溶胶-凝胶法制备高比表面积、多作用位点的双功能化(dspe和磷脂)的杂化整体材料，最后是通过磷酸基团与金属离子的亲和作用进行螯合，最后得到dspe和imac双功能化的杂化整体材料。

22、本发明所制备的杂化整体材料具有良好的物理和化学稳定性，能够长期分散在pbs中存于室温(25±5℃)，并且对evs有富集作用，可以利用dspe脂链尾嵌插入磷脂双分子膜中实现非共价键形式的富集，并且利用ti4+和evs膜中的磷酸官能团的金属螯合作用实现富集，从而实现对evs的双功能富集。

23、本发明还提供一种上述制备方法制备得到的用于富集细胞外囊泡的双功能杂化整体材料。

24、本发明还提供上述的用于富集细胞外囊泡的双功能杂化整体材料在富集细胞外囊泡的应用，包括如下步骤：

25、s21：将生物样本、pbs溶液、壬基酚聚氧乙烯醚和曲拉通x-100混合，得到混合溶液；

26、s22：将所述混合溶液孵育后除杂，完成对细胞外囊泡的富集。

27、优选的，所述步骤s22中，孵育的温度为室温(25±5℃)，孵育的时间为0.1-2h。

28、优选的，所述生物样本为细胞培养液、血浆、尿液、唾液或脑脊液。

29、本发明的技术方案相比现有技术具有以下优点：

30、1、本发明所制备的杂化整体材料具有良好的物理和化学稳定性，能够长期分散在pbs中存于室温，并且对evs有富集作用，可以利用材料表面大量的dspe脂链尾嵌插入磷脂双分子膜中实现非共价键形式的富集，同时利用ti4+和evs膜中的磷酸基团的金属螯合作用实现富集，从而实现对evs的双功能富集。

31、2、本发明所制备的杂化整体材料可以在常温下高效富集evs，制备过程有简单易操作、重现性好、成本低和不需要昂贵的仪器设备等优点。