枇杷抗寒基因EjFAD8及其编码的蛋白与应用

本发明属于植物基因工程，具体涉及枇杷抗寒基因ejfad8及其编码的蛋白和应用。

背景技术：

1、枇杷是蔷薇科苹果亚科枇杷属的亚热带常绿植物，是极具营养的经济果树。枇杷每年7-9月份进行花芽分化，在10-12月开花坐果，因此受温度影响，极易受到秋冬低温及冻害影响从而限制枇杷产量(蒋际谋，陈秀萍，邓朝军，许奇志，郑少泉.(2018).我国枇杷产业优劣势分析与发展对策.中国园艺文摘，34(4)，4)。中国的主要枇杷产区内，均有受冻害影响致使枇杷减产甚至死亡的报道(蔡礼鸿，(2012).枇杷学.中国农业出版社)。枇杷有较久的栽培历史，在栽培枇杷过程中，培育具有较强抗逆性，高产的优质枇杷品种逐渐成为解决枇杷低温冻害的有效措施之一。三倍体枇杷相比二倍体枇杷具有果实无核，营养生长旺盛的特点(彭思维，王永清，严娟，陶炼.(2011).三倍体枇杷育种的研究进展.全国枇杷学术研讨会)。在抗寒方面，研究表明天然三倍体枇杷的抗寒性普遍高于二倍体(王晓辉，郭启高，何桥，李晓林，向素琼，汪卫星等.(2013).8份枇杷种质的抗寒性和耐热性研究初探.全国枇杷学术研讨会论文)；四倍体与抗寒性较强二倍体杂交得到的三倍体f1代也表现出冬季具有较亲本光合效率高，光系统更稳定及更抗寒的性状(刘明秀，王泓丁，张宇娜，张帮燕，刘松，李韵佳等.(2021).三倍体枇杷与其四倍体和二倍体亲本光系统活性差异.园艺学报(048-001))。然而迄今为止，枇杷耐寒的分子机制尚不清楚，对调控枇杷响应冷冻胁迫的有效基因知之甚少。在冷冻胁迫下，植物细胞膜的流动性和稳定性是植物在冷冻胁迫下生存的关键因素之一。细胞膜上脂质的不饱和度的增加能够降低膜表面的疏水性及增加膜的流动性(takahashi d，uemura m，kawamura y.(2018).freezing tolerance of plantcells:from the aspect of plasma membrane and microdomain:adaptationmechanisms and their applications[j].advances in experimental medicine andbiology)。在多种草本及木本植物中的研究表明，冷冻胁迫下植物多不饱和脂肪酸的水平显著影响植物的抗寒及耐冻性(mikami k，murata n.(2003).membrane fluidity and theperception of environmental signals in cyanobacteria and plants[j].prog lipidres，42:527–543；los da.(2004).murata n membrane fluidity and its roles in theperception of environmental signals[j].biochim biophys acta.1666:142–157；martz f，kiviniemi s，palva te，sutinen ml.(2006).contribution of omega-3fattyacid desaturase and 3-ketoacyl-acp synthase ii(kasii)genes in the modulationof glycerolipid fatty acid composition during cold acclimation in birchleaves.j exp bot.57:897–909；renaut j，hoffmann l，hausman jf.(2005).biochemicaland physiological mechanisms related to cold acclimation and enhancedfreezing tolerance in poplar plantlets.physiol planta.125:82–94；zhou z，wangm，zhao s，et al.(2010).changes in freezing tolerance in hybrid poplar causedby up-and down-regulation of ptfad2 gene expression[j].transgenic research.19(4):647-654)。其中，脂肪酸去饱和酶(fad)主要负责膜脂去饱和，在植物受到低温甚至冷冻胁迫时提高表达量并使脂质不饱和度增加以此响应胁迫(hernández ml，padilla m n，sicardo m d，mancha，m.，and martínez-rivas，j.m.(2010).effect of differentenvironmental stresses on the expression of oleate desaturase genes and fattyacid composition in olive fruit[j].phytochemistry，2011，72，178–187)。

2、脂肪酸去饱和酶(fad)的功能在其他植物中已经取得了一定进展，脂肪酸的去饱和主要由其家族成员完成。fad主要是完整的膜结合型蛋白，大部分定位在内质网及叶绿体(bhunia r k，kaur r，mrinal k and maiti m k.(2016).metabolic engineering offatty acid biosynthetic pathway in sesame(sesamum indicum l.):assemblingtools to develop nutritionally desirable sesame seed oil[j].phytochem.rev.15，799–811)。根据引入双键的差异，fad分为ω-3和ω-6型去饱和酶并催化油酸合成亚油酸(berberich t，harada m，sugawara k，kodama h，iba k，and kusano，t.two maize genesencodingω-3fatty-acid desaturase and their differential expression totemperature[j].plant mol.biol，1998，36，297–306)。温度能都显著影响fad基因的表达，研究表明低温诱导油橄榄中fad的表达上调以响应低温胁迫(hernández m l，padilla mn，mancha m，and martínez-rivas j m.(2009).expression analysis identifies fad2-2 as the olive oleate desaturase gene mainly responsible for the linoleicacid content in virgin olive oil[j].j.agric.food chem.57，6199–6206)。拟南芥中长期低温会导致fad突变体膜脂不饱和度下调，显著影响叶绿体发育并枯萎死亡(miquelm，james d jr，dooner h，browse j.(1993).arabidopsis requires polyunsaturatedlipids for low-temperature survival[j].proc natl acad sci u s a.90(13):6208-12)。fad的转基因植物表现出比野生型更好的耐寒性，表明fad家族对冰冻胁迫下植物的膜脂的稳定性有重要作用(zhou z，wang m，zhao s，et al.(2010).changes in freezingtolerance in hybrid poplar caused by up-and down-regulation of ptfad2geneexpression[j].transgenic research，19(4):647-654)。

3、枇杷易受到低温冰冻灾害使产量降低，而通过对枇杷fad基因调控解析，有利于对不饱和脂肪酸功能的进一步解析，对于枇杷的抗低温胁迫有重要作用，同时为分子标记等奠定理论基础。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供一个枇杷脂肪酸去饱和酶相关基因ejfad8及其编码的蛋白质和应用。

2、首先，本发明提供枇杷ejfad8蛋白，其为：

3、1)由seq id no.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或

4、2)在seq id no.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。

5、本发明还提供编码所述枇杷ejfad8蛋白的基因。

6、优选的，所述基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

7、本发明还提供编码所述ejfad8蛋白的基因，优选的，所述基因的cdna序列如seqid no.1所示。

8、本发明提供了用于扩增所述基因的引物对，其中，上游引物的核苷酸序列如seqid no.3所示；下游引物的核苷酸序列如seq id no.4所示。

9、本发明提供含有所述基因的过表达载体，宿主细胞和工程菌。

10、本发明还提供所述基因在调控枇杷抗寒中的用途。

11、在本发明一个具体实施方案中，所述基因在低温胁迫下通过增加不饱和脂肪酸的合成来增加植物抗寒性。

12、在本发明一个具体的实施方案中，所述基因在低温下通过增加低温调控通路相关基因的表达以及降低h2o2含量来增强植物抗寒性

13、本发明提供了一种转化体，所述转化体由上述表达载体转化宿主获得。

14、本发明提供了枇杷抗寒基因ejfad8及其蛋白质、表达载体或转化体在提高枇杷抗寒性育种中的应用。

15、本发明从具有抗寒高光效的三倍体品种中克隆得到1个与枇杷抗寒密切相关的基因ejfad8，发现其定位于叶绿体。通过实时荧光定量pcr证实了ejfad8基因在枇杷低温处理后表达量显著升高，其在抗寒高光效的三倍体中表达最高，也表明了ejfad8基因具有提高枇杷低温抗逆性的作用。利用基因工程手段构建了ejfad8基因的植物过表达载体，将其在野生型拟南芥中超量表达，能促进fad8调控的下游不饱和脂肪酸sqdg的积累，同时显著改变了低温胁迫途径关键调控通路ice-cbf-cors中相关基因的变化，并降低低温胁迫引起的h2o2含量的积累，最终提高拟南芥的抗寒性。本发明为被子植物的低温胁迫调控提供了良好的应用前景。