鉴别日本血吸虫和东毕吸虫的分子标志物及应用的制作方法

本发明涉及基因检测，涉及鉴别日本血吸虫和东毕吸虫的分子标志物及应用，具体涉及能够区分日本血吸虫的、基于东毕吸虫特异性基因的real-time pcr检测方法的建立及应用；能够鉴别日本血吸虫和东毕吸虫的real-time pcr检测方法的建立及应用。

背景技术：

1、东毕吸虫(orientobilharzia turkestanicum，ot)属于分体科、东毕属。东毕吸虫病是东毕吸虫寄生于哺乳动物的肝门静脉和肠系膜静脉系统内引起的一种疾病，成虫、虫卵、尾蚴以及幼虫都可以对宿主造成一系列的损害严重时引起牛、羊的大批死亡，严重威胁畜牧业的健康发展。常见虫种是土耳其斯坦东毕吸虫。据报道，此病在我国的分布相当广泛，多呈地方性流行，宿主动物有绵羊、山羊、黄牛、水牛、骆驼和马属动物及一些野生的哺乳动物，主要危害牛和羊。同时，东毕吸虫尾蚴还能引起人的尾蚴性皮炎，对疫区周围生活的人群身体健康构成严重威胁，是一种严重的人兽共患寄生虫病。

2、日本血吸虫(schistosoma japonicum，sj)属于吸虫纲，复殖亚纲，复殖目，裂体科，裂体属。日本血吸虫的终末宿主包括人、水牛、黄牛、山羊、绵羊、猪、马、骡和狗等40余种哺乳动物。其中水牛、黄牛、山羊和绵羊等患病家畜是日本血吸虫的主要传染源。目前，在全球74个国家和地区中，约有2亿血吸虫病感染者，其中1.2亿人表现出血吸虫病的临床症状，2千万人患病严重，有6亿人口受血吸虫病感染威胁。血吸虫病仍是一个需要重视的公共卫生问题，被世界银行(world bank)、世界卫生组织(who)和联合国热带病研究发展特别规划署(tdr)列为重点研究、检测、防控的六大热带病之一。

3、日本血吸虫病在我国长江流域的安徽、江苏、湖南、湖北、江西、四川、云南等省份流行。东毕吸虫病在我国的甘肃、内蒙古、四川、湖南、新疆、江苏、陕西、贵州、青海、宁夏、辽宁、吉林、黑龙江、广西、北京、山西、湖北、福建、云南等20个省、市、自治区流行。东毕吸虫病和日本血吸虫病重合的省份有安徽、江苏、湖南、湖北、四川、云南。

4、随着药物治疗已经在血吸虫病流行国家的大规模使用，人和家畜的日本血吸虫病感染率和感染强度已经大幅度下降，消除该病已被提上2030年健康中国国家战略规划的议事日程。目前，日本血吸虫病的常用的诊断方法有病原学诊断和免疫学诊断等，病原学诊断是该病诊断的金标准。然而，对东毕吸虫病的诊断研究相对较少，目前主要以免疫学诊断研究为主(ji等，2020)。

5、核酸诊断具有灵敏度高，特异性强的特点，具有血吸虫病早期诊断、鉴别诊断及疗效考核的潜力。目前，核酸诊断方法已广泛用于疾病诊断，肿瘤诊断等，其敏感性和特异性已得到认可。由于缺少东毕吸虫的基因组数据，东毕吸虫的分子生物学诊断方法几乎未有报道。近几年开展的日本血吸虫病的分子生物学诊断方法研究中，未见开展其与东毕吸虫进行交叉反应性的实验，如在重组酶聚合酶扩增(rpa)技术检测日本血吸虫核酸方法的建立与初步评价中，开展了日本血吸虫与曼氏血吸虫、埃及血吸虫、华支睾吸虫、大片吸虫、卫氏并殖吸虫、牛带绕虫的交叉反应实验(wang等，2020)；在日本血吸虫病核酸检测方法的建立及初步应用的研究中，只进行了日本血吸虫与前后盘吸虫、大片吸虫、弓形虫、旋毛虫、裂头蚴、住肉孢子虫、隐孢子虫和捻转血矛线虫的交叉反应实验(guo等，2021)。

6、我们在研究中发现，日本血吸虫和东毕吸虫都可从虫卵中孵化出毛蚴，且两种毛蚴的大小及运动轨迹极为相似，传统的病原学诊断(毛蚴孵化法，mh)难以区分两种虫体。此外，鉴于目前的分子生物学诊断研究未有有效区分日本血吸虫与东毕吸虫这两种虫体的证据，且我们在实验中发现，日本血吸虫与东毕吸虫在分子生物学诊断中确实存在一定的交叉反应，这极易造成日本血吸虫病的误诊，进而对国家进一步控制和消除血吸虫病的计划造成影响，因此迫切需要建立更敏感和准确的检测方法对这两种疾病进行精确诊断及区分。

技术实现思路

1、本发明提供了可用于区分、鉴别日本血吸虫和东毕吸虫的分子标志物，并构建了敏感性高、特异性强、并可以区分、鉴别日本血吸虫和东毕吸虫的qpcr检测方法(sybrgreen染料法和taqman探针法)，能够准确、快速地区分日本血吸虫和东毕吸虫。

2、首先，本发明提供一种可以准确、快速地区分日本血吸虫和东毕吸虫的分子标记，所述分子标记为：

3、ot-f:5'-ctcagataaccgcctattctta-3'

4、ot-r:5'-cagtcttctatcgaacctctc-3'

5、本发明提供了一种用于区分日本血吸虫的东毕吸虫的qpcr(sybr green染料法)检测方法，所述方法应用一组敏感性高和特异性强的东毕吸虫检测用引物，其引物的核苷酸序列为ot-f:5'-ctcagataaccgcctattctta-3'

6、ot-r:5'-cagtcttctatcgaacctctc-3'

7、扩增片段为130bp。

8、本发明使用实时荧光定量pcr(sybr green染料法)的反应体系及扩增条件如下：

9、qpcr(sybr green法)反应体系：sybr master mix 10μl，上下游引物各0.4μl，模板1μl，去离子水8.2μl，使体系达到20μl。引物用双蒸水稀释到10pmol/μl的浓度；推荐模板浓度范围在5pg/μl-0.5ng/μl。

10、qpcr(sybr green法)扩增条件：95℃30s预变性，95℃15s，60℃30s，72℃15s，35个循环。经实验样本验证，可用于区分日本血吸虫的东毕吸虫检测。

11、对qpcr(sybr green法)扩增产物进行分析，可选择以下任一方法：

12、1.qpcr(sybr green法)产物进行琼脂糖凝胶电泳分析判断；

13、2.qpcr(sybr green法)的扩增曲线结合熔解曲线判断。

14、上述检测方法，用核酸提取试剂盒从待测样本中提取虫体基因组dna。

15、上述检测方法，产物的扩增曲线在ct值小于33时形成特征峰并且产物的熔解曲线在84℃形成特征峰，即显示阳性；当扩增曲线在ct值为33-34之间形成特征峰并且熔解曲线在84℃形成特征峰时，待测样本为疑似；当扩增曲线在ct值大于34形成特征峰并且熔解曲线在84℃形成特征峰时，待测样本为阴性。

16、本发明也可以用常规pcr仪进行扩增，产物进行琼脂糖凝胶电泳进行分析判断。

17、其次，本发明提供一种可以准确、快速地鉴别日本血吸虫和东毕吸虫的分子标记，所述分子标记为：

18、sj-f1:5’-tcagacaatcgtttattcttagc-3’

19、sj-r1:5’-tgatggcaatatggtctatttg-3’

20、sj-p1:5’-cataaggagagacaccgcctaacg-3’

21、ot-f2:5’-ctcagataaccgcctattctta-3’

22、ot-r2:5’-cagtcttctatcgaacctctc-3’

23、ot-p2:5’-cgaacaccaactttaggcatagggaa-3’

24、进一步的，本发明提供一种用于鉴别日本血吸虫和东毕吸虫的核酸检测方法，所述应用方法使用两组敏感性高和特异性强的东毕吸虫检测用引物及探针，其引物和探针的核苷酸序列为

25、sj-f1:5’-tcagacaatcgtttattcttagc-3’

26、sj-r1:5’-tgatggcaatatggtctatttg-3’

27、sj-p1:5’-cataaggagagacaccgcctaacg-3’

28、ot-f2:5’-ctcagataaccgcctattctta-3’

29、ot-r2:5’-cagtcttctatcgaacctctc-3’

30、ot-p2:5’-cgaacaccaactttaggcatagggaa-3’

31、本应用的另一目的是提供了用于鉴别检测的qpcr(taqman探针法)反应体系及扩增条件，可根据实际需要选择相对应的反应体系及扩增条件。

32、反应体系如下：taqman master mix 10μl，上下游引物f1、r1、f2、r2各加0.6μl，探针p1加0.6μl，p2加0.4μl，模板1μl，去离子水5.2μl，使体系达到20μl。引物用双蒸水稀释到10pmol/μl的浓度；推荐模板浓度范围在5pg/μl-0.5ng/μl。

33、qpcr(taqman探针法)扩增条件如下：95℃30s预变性，95℃15s，60℃30s，72℃15s，40个循环。经实验样本验证，可用于日本血吸虫与东毕吸虫的鉴别检测。

34、对qpcr(taqman探针法)扩增产物进行分析，可选择real-time pcr的扩增曲线判断。

35、上述检测方法，用核酸提取试剂盒从待测样本中提取dna。

36、上述检测方法，产物的扩增曲线在ct值小于35时有特异性扩增，即显示阳性；当扩增曲线在ct值为35-37之间有特异性扩增，待测样本为疑似；当扩增曲线在ct值大于37有特异性扩增，待测样本为阴性。

37、本应用使用了一种鉴别日本血吸虫与东毕吸虫的分子标志物及检测方法；可用于监测及区分水体中是否含有日本血吸虫和东毕吸虫的毛蚴及尾蚴，并可对日本血吸虫及东毕吸虫进行虫种鉴定。