测序方法与流程

本发明涉及测序领域，具体的，本申请涉及一种测序方法。

背景技术：

1、下一代测序(next-generation sequencing,ngs)又称高通量测序或大规模平行测序，最早是从焦磷酸测序的原理上发展起来的，其采用边合成边测序作为基本设计理念，以待测核酸作为模板，通过一系列碱基延伸反应引入特定的核苷酸，进而可以基于所引入核苷酸的类型，完成对待测核酸的序列确定。

2、因为高通量测序一次可同时检测大量靶基因及其变异位点，检测灵敏度和特异性高，兼具定性和定量检测，并且对同样数量的基因和位点进行检测的检测费用相对较低，因而在无创产前筛查(noninvasive prenatal screening,nips)、肿瘤基因突变、遗传病、胚胎植入前遗传学筛查(preimplantation genetic screening,pgs)和胚胎植入前遗传学诊断(preimplantationgenetic diagnosis,pgd)、病原微生物及宏基因组学(metagenomics)等领域展现了极为广阔的临床及科研应用前景，成为目前dna和rna序列分析最高效的工具，也是精准医学时代研究和临床疾病诊疗的支撑技术。

3、然而，目前的边合成边测序技术仍有待进一步改进。例如，目前的测序方法，不管是边合成边测序(sequencing by synthesis,sbs)还是边结合边测序(sequencing bybinding,sbb)测序技术，一轮测序反应只能识别一个位置上目标核酸模板上的一个碱基。如果在一轮测序反应中，位于目标核酸模板不同的两个位点同时产生测序信号，则两个测序信号会互相干扰，混淆信号来源。这限制了测序的速度和单位时间内可达到的数据通量。

技术实现思路

1、本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够同时得到一个位点内不同测序模板的测序结果的方法，即可以同时对一个位置内的多个不同的测序模板进行测序的方法。

2、在本申请的一个方面，本申请提出了一种测序方法，其包括：

3、检测测序反应过程中固相载体表面指定位置的测序信号，所述指定位置至少包括两个测序信号；

4、基于所述测序信号的差异，获取所述指定位置处的碱基类型，实现所述指定位置的测序。

5、根据本申请的实施例，通过该方法，可以在一个位置(在采集测序信号时，该点对应为一个信号点；在进行数据分析时，该位点对应为一个数据点)中，同时获取多个测序模板或待测核酸序列产生的测序信号，并且根据测序信号的强度差异，对这些测序信号在不同的测序模板或待测核酸序列之间进行归类，从而实现对同一位置产生的多信号进行区分，获得多个测序模板或待测核酸的测序结果。

6、在本申请的又一方面，本申请提出了一种测序方法，包括：构建测序文库，其中，所述测序文库分子包括多个核酸分子，且每一核酸分子携带：第一标签，所述第一标签具有第一引物杂交位点，以及连接于所述第一引物杂交位点3’端的第一标签序列；第二标签，所述第一标签具有第二引物杂交位点，以及连接于所述第二引物杂交位点3’端的第二标签序列；靶分子，所述靶分子连接于所述第一标签和所述第二标签之间，所述靶分子包括第三引物杂交位点以及连接于所述第三引物杂交位点3’端的插入片段，且所述靶分子通过所述第三引物杂交位点与所述第一标签的3’端连接，所述靶分子通过所述插入片段与所述第二标签的5’端连接；将所述测序文库中的核酸分子固定在固相载体表面后进行扩增，形成固定有核酸分子簇的位置；添加所述第一引物、阻断分子和所述第二引物与所述核酸分子簇中的核酸分子进行杂交，其中，所述第一引物和所述阻断分子为结合所述第一引物杂交位点的引物，所述第二引物为结合所述第二引物杂交位点的引物，且所述阻断分子具有不可延伸的3’末端；对所述第一标签和所述第二标签同步实施多轮测序反应，获取每轮测序反应不同通道的测序信号；基于各测序信号的强度差异，确定所述第一标签序列和所述第二标签序列的序列。

7、根据本申请的实施例，通过一次测序，可以同时对测序文库分子两端的接头进行测序，同步实现双标签(dual-indexing)测序，有效解决两个接头分别测序存在的测序效率低的问题。

8、本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

技术特征：

1.一种测序方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的测序方法，其特征在于，所述固相载体上具有多个位置，所述位置固定多个核酸模板，

3.根据权利要求2所述的测序方法，其特征在于，检测测序反应过程中固相载体表面指定位置的测序信号，包括：对所述第一位置的核酸模板实施多轮测序反应，获取所述第一位置各通道的测序信号；

4.根据权利要求2或3所述的测序方法，其特征在于，所述位置包括第二位置，所述第二位置中的所述核酸模板为同一核酸分子的拷贝；

5.根据权利要求4所述的测序方法，其特征在于，所述第二位置中，每一所述核酸模板包括：

6.根据权利要求4或5所述的测序方法，其特征在于，检测测序反应过程中固相载体表面指定位置的测序信号，包括：对所述第二位置的核酸模板实施多轮测序反应，获取所述第二位置各通道的测序信号；

7.根据权利要求1-6任一项所述的测序方法，其特征在于，所述位置包括第三位置，所述第三位置中的核酸模板相同，且每一所述核酸模板具有一个相同的引物杂交位点。

8.根据权利要求2-6任一项所述的测序方法，其特征在于，同一所述位置中，不同的所述待测核酸序列中的至少两个在至少一轮测序反应中产生不同的测序信号。

9.根据权利要求1-8任一项所述的测序方法，其特征在于，所述固相载体为具有阵列微孔的基板，且每一所述位置对应一个微孔所在的位置。

10.一种测序方法，其特征在于，包括：

技术总结
本申请提出了一种测序方法，该测序方法包括：检测测序反应过程中固相载体表面指定位置的测序信号，且所述指定位置至少包括两个测序信号；基于所述测序信号的差异，获取所述指定位置处的碱基类型，实现所述指定位置的测序。该方法实现多信号位点的测序，提高了测序反应的测序速度和单位时间内的测序通量。

技术研发人员：李林森,孙雷
受保护的技术使用者：深圳市真迈生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/5/10