一种基于重组酶的十足目虾虹彩病毒Ⅰ型试纸条型恒温扩增检测试剂盒的制作方法

本发明涉及生物检测，特别是涉及一种基于重组酶的十足目虾虹彩病毒ⅰ型试纸条型恒温扩增检测试剂盒。

背景技术：

1、虾类疫病的传统检测方法是pcr(polymerase chain reaction)，但该方法需要专用扩增仪器，不适合基层及现场快速检测。近来，愈来愈多操作简便、检测周期短的分子生物检测技术广泛应用于十足目虹彩病毒ⅰ型(div1)，其中，重组酶聚合酶扩增技术(rpa)发展较为迅速。该技术无需造价高昂的升降温仪器，在恒温条件下10min内即可完成核酸扩增，反应快速而灵敏，扩增产物可以通过构建荧光探针法进行实时定量检测，也可以与dna芯片、琼脂糖凝胶电泳、侧流层析试纸条等多种检测技术相结合进行检测，适合基层实验室及一线口岸的现场检测。

2、尹伟力等根据十足目虹彩病毒ⅰ型的atp酶基因保守序列设计特异性引物，通过条件优化，建立基于重组酶聚合酶扩增技术的十足目虹彩病毒ⅰ型检测方法，该方法特异、灵敏，但是需要借助凝胶成像仪观察结果。张徐俞等根据已发表的div1的mcp基因保守序列，设计探针和引物，建立了rpa-cas12a快速检测方法，该方法需要利用荧光定量pcr仪进行扩增。qian-jun huang等根据发表的div1的mcp基因保守序列，设计探针和引物，建立了rpa快速检测方法，需要荧光定量pcr仪。tong guixiang等根据十足目虹彩病毒ⅰ型的atp酶基因保守序列设计特异性引物，建立了rpa快速检测方法，该方法需要借助凝胶成像仪观察结果。黄俊等根据mcp基因设计特异性引物和探针，建立rpa快速检测方法，需要用到荧光定量pcr仪。

3、目前已经公布的基于重组酶的十足目虹彩病毒ⅰ型检测方法均需借助荧光定量pcr仪或者凝胶成像仪等仪器，不适合基础实验室及虾苗养殖场的现场快速检测。

4、因此，亟需建立一种操作简便，检测时间短，特异性好，灵敏度高，仅需普通恒温设备的十足目虹彩病毒ⅰ型检测方法，适用于基础实验室及虾苗养殖场的现场快速检测，从而可以有效对十足目虹彩病毒ⅰ型进行早期监控及日常检测。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种基于重组酶的十足目虾虹彩病毒ⅰ型试纸条型恒温扩增检测试剂盒，以解决上述现有技术存在的问题，本发明提供的试剂盒操作简便，检测时间短，特异性好，灵敏度高，仅需普通恒温设备就可以实现十足目虹彩病毒ⅰ型的快速检测。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供一种检测十足目虾虹彩病毒ⅰ型的引物对和探针组合，所述引物对的核苷酸序列如seq id no.4-5所示，所述探针的核苷酸序列如seq id no.1所示。

4、进一步地，所述探针的5’端修饰fam基团，3’端修饰c3spacer基团，5’端的30bp和31bp碱基由一个thf隔开。

5、本发明还提供上述的引物对和探针组合在制备十足目虾虹彩病毒ⅰ型试纸条型恒温扩增检测试剂盒中的应用。

6、本发明还提供一种十足目虾虹彩病毒ⅰ型试纸条型恒温扩增检测试剂盒，包括上述的引物对和探针组合。

7、进一步地，所述十足目虾虹彩病毒ⅰ型试纸条型恒温扩增检测试剂盒还包括阳性质控质粒。

8、进一步地，所述阳性质控质粒的核苷酸序列如seq id no.8所示。

9、进一步地，所述十足目虾虹彩病毒ⅰ型试纸条型恒温扩增检测试剂盒还包括abuffer、ddh2o和醋酸镁。

10、进一步地，所述十足目虾虹彩病毒ⅰ型试纸条型恒温扩增检测试剂盒的反应体系为：abuffer 29.4μl、10μm上游引物2μl、10μm下游引物2μl、10μm探针0.6μl、ddh2o 11.5μl、模板2μl和醋酸镁2.5μl。

11、进一步地，所述十足目虾虹彩病毒ⅰ型试纸条型恒温扩增检测试剂盒的反应温度为39℃，反应时间为10min。

12、本发明公开了以下技术效果：

13、本发明根据十足目虹彩病毒ⅰ型保守序列atp酶基因设计了一对特异性引物，基于重组酶聚合酶扩增技术，建立了一种操作简便，检测时间短，特异性好，灵敏度高，仅需普通恒温设备的十足目虹彩病毒ⅰ型的检测试剂盒，该检测试剂盒适用于基础实验室及虾苗养殖场的现场快速检测，可以有效对十足目虹彩病毒ⅰ型进行早期监控及日常检测。

技术特征：

1.一种检测十足目虾虹彩病毒ⅰ型的引物对和探针组合，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如seq id no.4-5所示，所述探针的核苷酸序列如seq id no.1所示。

2.根据权利要求1所述的引物对和探针组合，其特征在于，所述探针的5’端修饰fam基团，3’端修饰c3spacer基团，5’端的30bp和31bp碱基由一个thf隔开。

3.一种如权利要求1或2所述的引物对和探针组合在制备十足目虾虹彩病毒ⅰ型试纸条型恒温扩增检测试剂盒中的应用。

4.一种十足目虾虹彩病毒ⅰ型试纸条型恒温扩增检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物对和探针组合。

5.根据权利要求4所述的十足目虾虹彩病毒ⅰ型试纸条型恒温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述十足目虾虹彩病毒ⅰ型试纸条型恒温扩增检测试剂盒还包括阳性质控质粒。

6.根据权利要求5所述的十足目虾虹彩病毒ⅰ型试纸条型恒温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述阳性质控质粒的核苷酸序列如seq id no.8所示。

7.根据权利要求4所述的十足目虾虹彩病毒ⅰ型试纸条型恒温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述十足目虾虹彩病毒ⅰ型试纸条型恒温扩增检测试剂盒还包括abuffer、ddh2o和醋酸镁。

8.根据权利要求7所述的十足目虾虹彩病毒ⅰ型试纸条型恒温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述十足目虾虹彩病毒ⅰ型试纸条型恒温扩增检测试剂盒的反应体系为：abuffer29.4μl、10μm上游引物2μl、10μm下游引物2μl、10μm探针0.6μl、ddh2o11.5μl、模板2μl和醋酸镁2.5μl。

9.根据权利要求8所述的十足目虾虹彩病毒ⅰ型试纸条型恒温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述十足目虾虹彩病毒ⅰ型试纸条型恒温扩增检测试剂盒的反应温度为39℃，反应时间为10min。

技术总结
本发明公开了一种基于重组酶的十足目虾虹彩病毒Ⅰ型试纸条型恒温扩增检测试剂盒，涉及生物检测技术领域。所述十足目虾虹彩病毒Ⅰ型试纸条型恒温扩增检测试剂盒包括一种引物对和探针组合，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.4‑5所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的试剂盒操作简便，检测时间短，特异性好，灵敏度高，仅需普通恒温设备就可以实现十足目虹彩病毒Ⅰ型的快速检测，适用于基础实验室及虾苗养殖场的现场快速检测，可以有效对十足目虹彩病毒Ⅰ型进行早期监控及日常检测。

技术研发人员：袁雪梅,姚嘉赟,黄雷,蔺凌云,潘晓艺,陈静
受保护的技术使用者：浙江省淡水水产研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13