用于检测川崎病相关的CCR7基因甲基化程度的试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及基因诊断试剂盒，具体讲是一种用于检测川崎病相关的ccr7基因甲基化程度的试剂盒及其应用。

背景技术：

1、川崎病(kawasaki disease，kd)又称皮肤黏膜淋巴结综合征，1967年由日本学者tomisaku kawasaki(川崎富作)医生最初发现并报道，是以全身性小血管炎为主要病理变化的急性发热出疹性疾病。kd主要累及冠状动脉，导致动脉瘤和血栓形成，引起严重的并发症，其中最严重的是冠状动脉病变，心肌梗塞和冠状动脉瘤形成。目前kd已取代风湿热成为儿童后天性心脏病的主要原因。典型kd的诊断标准认为具有以下6个临床标准中的5个即可诊断为kd：1)持续5天以上的不明原因发热，抗生素治疗无效；2)双眼球结膜充血，无脓性分泌物渗出；3)口唇皲裂、潮红，口腔黏膜弥散性充血，杨梅舌；4)急性期手足硬肿，掌跖红斑，恢复期指趾端有膜状脱屑或肛周脱屑；5)多形性充血性红斑、皮疹；6)非化脓性颈部淋巴结肿大，直径可达1.5cm甚至更大。也有研究者认为对于持续5d以上的不明原因发热、伴有其他3项主要临床表现，加上二维超声心动图或冠脉造影提示存在冠脉病变者也能确诊为kd。

2、ccr7(c-c motif chemokine receptor 7)基因编码的蛋白质是cc趋化因子受体7，作为g蛋白偶联受体家族的成员，在各种淋巴组织中表达并激活b和t淋巴细胞，控制记忆t细胞向发炎组织的迁移，并刺激树突状细胞的成熟。趋化因子是细胞分泌的小细胞因子或信号蛋白。趋化因子的一个主要作用是在引导细胞迁移中充当趋化剂，由g蛋白偶联受体转导，这些受体解离以激活多种下游通路，导致细胞极化和肌动蛋白重组。有研究报道ccr7基因表达改变是甲基化抑制剂5-aza对黑色素瘤细胞表观遗传学调控的主要作用途径。在t细胞功能与表观遗传学变化相关性研究结果也表明ccr7基因甲基化调控在免疫反应中发挥重要的作用。下游可能涉及jak-stat信号通路。

3、目前，国内外还没有公开任何关于用于检测川崎病相关的ccr7基因甲基化程度的试剂盒相关研究报道。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状，提供一种用于检测川崎病相关的ccr7基因甲基化程度的试剂盒及其应用。通过该试剂盒在外周血检测中得到的ccr7基因cg1位点以及cg1-cg2总体甲基化水平与川崎病相关。通过该试剂盒检测得到的ccr7基因cg1位点以及cg1-cg2总体甲基化水平与正常对照组具有显著性差异，甲基化水平显著升高，则判断患有川崎病。并且大剂量丙种球蛋白(ivig，静丙)治疗后ccr7基因cg1位点以及cg1-cg2总体甲基化水平发生显著性变化，甲基化值均显著降低，证明静丙治疗有效，病情显著好转，可以用于评估用药效果。

2、本发明的第一个目的是提供一种用于检测川崎病相关的ccr7基因甲基化程度的试剂盒，所述试剂盒包括一对ccr7基因启动子区域2个cg位点甲基化特异性扩增引物以及一条甲基化特异性测序引物；

3、所述甲基化特异性扩增引物的上游引物核苷酸序列如seq id no.1所示：

4、5’-biotin-taatgtttttagagataaaggggtagaaga-3’；

5、所述甲基化特异性扩增引物的下游引物核苷酸序列如seq id no.2所示：

6、5’-acacatctctaactccccaaca-3’；

7、所述甲基化特异性测序引物的核苷酸序列如seq id no.3所示：

8、5’-cctcatctaaattctacca-3’。

9、本发明的第二个目的是提供一种上述用于检测川崎病相关的ccr7基因甲基化程度的试剂盒的应用，用于川崎病的辅助诊断、筛查药物或评估用药效果。

10、本发明的有益效果是：

11、在外周血检测中，通过本发明试剂盒检测得到的ccr7基因cg1位点以及cg1-cg2总体甲基化水平与正常对照组具有显著性差异，甲基化水平显著升高，可诊断为患有川崎病。

12、本发明试剂盒可在静丙治疗后检测ccr7基因cg1位点以及cg1-cg2总体甲基化水平，如甲基化水平发生显著性变化，甲基化值均显著降低，证明静丙治疗有效，病情显著好转，可以用于评估用药效果。

13、在外周血检测中，通过本发明试剂盒检测得到的川崎病患者中ccr7基因cg1甲基化率与川崎病患者中ccr7基因cg1位点甲基化率与中心粒细胞百分比，纤维蛋白原，平均血红蛋白体积，体重，平均红细胞体积，免疫球蛋白a，血沉，球蛋白，肌酐，平均血红蛋白浓度以及年龄11项指标呈正相关。与淋巴细胞百分比，淋巴细胞绝对值，单核细胞百分比，白球比值，嗜酸性粒细胞，嗜酸性粒细胞绝对值，红细胞体积分布宽度，凝血酶时间，钙9项指标呈反相关。通过所述试剂盒检测得到的川崎病患者中ccr7基因cg1位点甲基化率可以作为临床川崎病患儿一项炎症性指标用于指导临床用药。

技术特征：

1.一种用于检测川崎病相关的ccr7基因甲基化程度的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括一对ccr7基因启动子区域2个cg位点甲基化特异性扩增引物以及一条甲基化特异性测序引物；

2.一种权利要求1所述的用于检测川崎病相关的ccr7基因甲基化程度的试剂盒的应用，其特征在于：用于川崎病的辅助诊断、筛查药物或评估用药效果。

3.根据权利要求2所述的用于检测川崎病相关的ccr7基因甲基化程度的试剂盒的应用，其特征在于：在外周血检测中，通过所述试剂盒检测得到的ccr7基因cg1位点以及cg1-cg2总体甲基化水平与正常对照组具有显著性差异，甲基化水平显著升高，可诊断为患有川崎病。

4.根据权利要求2所述的用于检测川崎病相关的ccr7基因甲基化程度的试剂盒的应用，其特征在于：在静丙治疗后检测ccr7基因cg1位点以及cg1-cg2总体甲基化水平，如甲基化水平发生显著性变化，甲基化值均显著降低，证明静丙治疗有效，病情显著好转，可以用于评估用药效果。

5.根据权利要求2所述的用于检测川崎病相关的ccr7基因甲基化程度的试剂盒的应用，其特征在于：在外周血检测中，通过所述试剂盒检测得到的川崎病患者中ccr7基因cg1甲基化率与川崎病患者中ccr7基因cg1位点甲基化率与中心粒细胞百分比，纤维蛋白原，平均血红蛋白体积，体重，平均红细胞体积，免疫球蛋白a，血沉，球蛋白，肌酐，平均血红蛋白浓度以及年龄11项指标呈正相关；与淋巴细胞百分比，淋巴细胞绝对值，单核细胞百分比，白球比值，嗜酸性粒细胞，嗜酸性粒细胞绝对值，红细胞体积分布宽度，凝血酶时间，钙9项指标呈反相关，通过所述试剂盒检测得到的川崎病患者中ccr7基因cg1位点甲基化率可以作为临床川崎病患儿一项炎症性指标用于指导临床用药。

技术总结
本发明公开一种用于检测川崎病相关的CCR7基因甲基化程度的试剂盒，所述试剂盒包括一对CCR7基因启动子区域2个CG位点甲基化特异性扩增引物以及一条甲基化特异性测序引物；所述甲基化特异性扩增引物的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：5’‑Biotin‑TAATGTTTTTAGAGATAAAGGGGTAGAAGA‑3’；所述甲基化特异性扩增引物的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：5’‑ACACATCTCTAACTCCCCAACA‑3’；所述甲基化特异性测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：5’‑CCTCATCTAAATTCTACCA‑3’；本试剂盒用于川崎病的辅助诊断、筛查药物或评估用药效果。

技术研发人员：俞蓓蓉,郑邦旭,吴军华,沈懿菁,朱丰盛,邱海燕,沈裕,黄锂新,鲁炜慧
受保护的技术使用者：宁波市妇女儿童医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13