哺乳动物定量表达系统的制作方法

本发明属于合成生物学和生物工程领域，涉及能够对哺乳动物细胞中一个或多个目的基因进行精确定量表达的系统和方法。

背景技术：

1、就多基因表达系统而言，将各蛋白的比例和数量维持在最优状态对于哺乳动物细胞中多亚基蛋白复合物的稳定性以及生物通路中各酶的协同功能来说至关重要。由于染色体缺失、重复或异位引起的蛋白数量的变化可能引起大量蛋白异常聚集，进而导致细胞功能失调等破坏性后果，例如肿瘤或神经退行性病变。在细胞中，为了将蛋白维持在所期望的比例和数量，存在多种机制来对蛋白水平进行精细调节和缓冲，以减轻环境和基因水平的波动造成的影响，此类机制包括负反馈、mrna出核限制、复合物中未组装亚基的靶向非指数性降解(targetednon-exponentialdegradation)等。特别地，研究发现，人类细胞和其它真核细胞对蛋白复合物中专性亚基(obligate subunit)的计量数的调控方式为，通过控制其合成速率(而非负反馈)来调节各亚基的比例。

2、直到最近，哺乳动物多基因体系下计量数的重要性才得到广泛认可。例如，在干细胞命运决定过程中，四种重编程因子oct4、sox2、klf4和c-myc的比例极大地影响了诱导多能干细胞的效率和质量。目前，本领域已表征了一些能够在哺乳动物宿主中定量表达的启动子库，但这些表达系统的表达强度与表达盒附近序列高度相关，因此难以实现对计量数进行精确的微调。在本发明中，通过将来自噬菌体的单体rna聚合酶(rnap)与mrna加帽酶(capping)融合，构建嵌合型加帽酶-rna聚合酶(capping-rnap)，由该融合蛋白中的rnap结构域驱动同源启动子的转录，实现对哺乳动物细胞背景下蛋白复合物中各蛋白的表达量和表达比例进行预测和精确控制。

技术实现思路

1、在第一方面，本发明涉及一种用于表达哺乳动物细胞中一个或多个目的基因的系统，所述系统包含：

2、嵌合型加帽酶-rna聚合酶，所述嵌合型加帽酶-rna聚合酶包含单体rna聚合酶结构域以及病毒加帽酶结构域；其中，所述单体rna聚合酶选自于由t7rna聚合酶(t7rnap)、t3rna聚合酶(t3 rnap)、k11 rna聚合酶(k11 rnap)、k1.5rna聚合酶(k1.5rnap)以及sp6rna聚合酶(sp6rnap)所组成的组；所述病毒加帽酶选自于由蓝舌病毒加帽酶、非洲猪瘟病毒加帽酶、棘阿米巴多食性拟病毒加帽酶、竹花叶病毒加帽酶以及痘病毒加帽酶所组成的组；以及

3、单体rna聚合酶识别的启动子，其中，所述t7 rna聚合酶识别的启动子选自于由seq id no：1-seq id no：54所组成的组；所述t3 rna聚合酶识别的启动子选自于由seq idno：161-seq id no：172所组成的组；所述k11 rna聚合酶识别的启动子选自于由seq idno：55-seq id no：112所组成的组；所述k1.5rna聚合酶识别的启动子选自于由seq id no：183-seq id no：234所组成的组；所述sp6 rna聚合酶识别的启动子选自于由seq id no：113-seq id no：160所组成的组。

4、在第二方面，本发明涉及一种用于表达哺乳动物细胞中一个或多个目的基因的系统，所述系统包含：

5、一个或多个嵌合型加帽酶-rna聚合酶基因表达盒，所述嵌合型加帽酶-rna聚合酶基因表达盒各自独立地包含嵌合型加帽酶-rna聚合酶编码序列，所述嵌合型加帽酶-rna聚合酶各自独立地包含单体rna聚合酶结构域以及病毒加帽酶结构域；其中，所述单体rna聚合酶选自于由t7 rna聚合酶、t3 rna聚合酶、k11 rna聚合酶、k1.5rna聚合酶以及sp6 rna聚合酶所组成的组；所述病毒加帽酶选自于由蓝舌病毒加帽酶、非洲猪瘟病毒加帽酶、棘阿米巴多食性拟病毒加帽酶、竹花叶病毒加帽酶以及痘病毒加帽酶所组成的组；以及

6、一个或多个目的基因表达盒，所述目的基因表达盒各自独立地包含单体rna聚合酶识别的启动子以及目的基因序列，其中，所述t7 rna聚合酶识别的启动子选自于由seqid no：1-seq id no：54所组成的组；所述t3 rna聚合酶识别的启动子选自于由seq id no：161-seq id no：172所组成的组；所述k11 rna聚合酶识别的启动子选自于由seq id no：55-seq id no：112所组成的组；所述k1.5rna聚合酶识别的启动子选自于由seq id no：183-seq id no：234所组成的组；所述sp6 rna聚合酶识别的启动子选自于由seq id no：113-seq id no：160所组成的组。

7、在第三方面，本发明涉及一种用于表达哺乳动物细胞中一个或多个目的基因的方法，所述方法包括：

8、构建一个或多个嵌合型加帽酶-rna聚合酶基因表达盒，所述嵌合型加帽酶-rna聚合酶基因表达盒各自独立地包含嵌合型加帽酶-rna聚合酶编码序列，所述嵌合型加帽酶-rna聚合酶各自独立地包含单体rna聚合酶结构域以及病毒加帽酶结构域；其中，所述单体rna聚合酶选自于由t7 rna聚合酶、t3 rna聚合酶、k11 rna聚合酶、k1.5rna聚合酶以及sp6rna聚合酶所组成的组；所述病毒加帽酶选自于由蓝舌病毒加帽酶、非洲猪瘟病毒加帽酶、棘阿米巴多食性拟病毒加帽酶、竹花叶病毒加帽酶以及痘病毒加帽酶所组成的组；以及

9、构建一个或多个目的基因表达盒，所述目的基因表达盒各自独立地包含单体rna聚合酶识别的启动子以及目的基因序列，其中，所述t7rna聚合酶识别的启动子选自于由seq id no：1-seq id no：54所组成的组；所述t3 rna聚合酶识别的启动子选自于由seq idno：161-seq id no：172所组成的组；所述k11 rna聚合酶识别的启动子选自于由seq idno：55-seq id no：112所组成的组；所述k1.5rna聚合酶识别的启动子选自于由seq id no：183-seq id no：234所组成的组；所述sp6 rna聚合酶识别的启动子选自于由seq id no：113-seq id no：160所组成的组。

10、在第四方面，本发明涉及第一方面所述的系统或第二方面所述的方法在制备疫苗方面的用途。

11、有益效果

12、在哺乳动物细胞中，大部分转录是环境依赖的，即，将同样的表达盒插入基因组不同的位置时，其转录翻译的强度不同。这一环境依赖属性极大阻碍了对哺乳动物宿主转录调控的定量研究。特别是针对需要同时控制多个基因表达量的生物学过程，现有技术难以做到对每个基因表达量或其表达比例进行精确控制。

13、本发明的表达系统组合使用非哺乳动物来源的单体rna聚合酶-加帽酶融合蛋白以及该单体rna聚合酶识别的启动子，避免了哺乳动物宿主中顺式以及反式作用元件对转录的干扰，实现对哺乳动物基因表达的定量和精确控制。该非环境依赖的表达系统能够有利地用于对哺乳动物细胞中一个或多个蛋白的表达量和/或表达比例进行精确控制，且所述表达量/表达比例可通过本发明的模型精确预测。如实施例展示的，哺乳动物宿主中单个基因的表达强度取决于融合蛋白中rnap亚基与其同源的启动子间的结合亲和力；该结合亲和力易于在原核生物中测定，且在哺乳动物宿主中的结合亲和力与在原核宿主中成正比。根据本发明的资源竞争模型，对于由单一capping-rnap驱动的多基因表达系统，各基因的相对表达量正比于各同源启动子的结合亲和力。这一定量结果在不同类型的哺乳动物细胞中(例如人胚胎肾细胞hek293t细胞系、中国仓鼠卵巢cho细胞系)均可观测到。可见，本发明的定量表达系统能够以模块化的方式应用于多种类型的哺乳动物细胞、组织或者生物体，实现对一个或多个目的基因进行定量精细调控。在这方面，本发明对哺乳动物中可使用的基因调控元件进行了扩展。

14、本发明的嵌合型rna聚合酶-加帽酶中的rna聚合酶结构域可为不同噬菌体来源的单体rna聚合酶，各rna聚合酶分别具有特异性识别的同源启动子库。各组rna聚合酶/同源启动子之间几乎不存在信号串扰，因此可在同一宿主内表达多种嵌合型rna聚合酶-加帽酶，并使用各单体rna聚合酶识别的同源启动子控制目的基因的表达，独立控制各目的基因的表达。能够根据具体需求对不同工作环境下的基因表达盒进行理性设计，借助本发明的表达系统能够搭建具有不同表达量和多样性的基因线路。就特异性启动子库而言，本发明包含了54种t7启动子、12种t3启动子、58种k11启动子、52种k1.5启动子以及48种sp6启动子，本领域技术人员能够根据具体强度需求对启动子进行精准选择，实现对基因线路的理性设计。

15、本发明还提供了利用单一种类的嵌合型rna聚合酶-加帽酶对两个或更多基因的相对表达强度进行定量控制的方法。不希望被理论所限地，由于在该实施方式中，各启动子转录均由相同的转录机器(transcriptionalmachinery，即rnap)驱动，由单一种类的嵌合型rna聚合酶-加帽酶控制的各特异性启动子的表达强度与该启动子与rnap的相对结合亲和力正相关，因此可将两个以上目的基因分别连接至由单一种类的rna聚合酶-加帽酶融合蛋白控制的特异性启动子的下游，对各目的基因的表达比例进行精确调控。此外，还可通过无自由参数的资源竞争模型对每一启动子的转录强度进行精确定量预测。如实施例所展示的，我们组合使用单一rna聚合酶-加帽酶融合蛋白以及相应的三种正交启动子，以可预测的方式优化了甲型流感病毒病毒样颗粒(virus-likeparticles，vlp)复合物中三种蛋白的表达比例，并将完整vlp复合物的产量大幅提高。此外，在采用本发明的双基因或三基因表达体系时，能够同时精确定量或以恒定比例表达多种抗原，实现多价疫苗。

16、在优选的实施方式中，可在本发明的rnap识别的启动子的上下游添加操纵序列，将这些启动子改造为诱导型启动子。例如，可在rnap识别的启动子的上下游添加一组或多组操纵序列，并在宿主中表达相应的反式激活因子(包括但不限于rpar、brar、bjar、tetr、c1434、phlf、hkcl、lmra、bm3r、tp901ci、cymr、ttgr以及lexa)，构建能够在哺乳动物宿主中响应诱导剂的诱导型启动子。如实施例所展示的，可采用这些诱导型启动子扩大诱导表达的动态范围，构建具有不同性能的转录和表达元件。在优选的实施方式中，第一启动子还可包含同源启动子序列(例如为双启动子)，从而利用同源启动子对capping-rnap的表达施加正反馈。针对rnap设置的该正反馈可进一步提高rnap的转录水平，进而提高一个或多个目的基因的总表达量。

17、由于本发明的表达系统具有环境不敏感的优异性质，避免了内源转录机器的干扰，可对多种蛋白进行定量共表达，因此可将本发明的系统和方法有利地用于高级疫苗工程、复杂蛋白药物制备、细胞命运编程和其他医疗用途。