一种基于NGS的实验恒河猴STR遗传标记组合、引物组、试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及实验动物遗传学，具体涉及一种基于ngs的实验恒河猴str遗传标记组合、引物组、试剂盒及其应用。

背景技术：

1、随着医学研究和生物技术的不断进步，涉及基因修饰、基因敲除、表观遗传学、基因编辑和非人灵长类实验动物中局部基因表达的精细调控等，使得非人灵长类动物资源变得更加具有成本效益和精炼。在创新药崛起的形势下，依照《药品非临床研究质量管理规范》等条例，所有新药的研发和疾病的诊断、治疗方法的确立与改进等都必须在非人灵长类实验动物身上获得可靠结论后，才能进入临床研究。因此，预计全球对非人灵长类实验动物资源的需求将不断增加，以满足更多新应用的需求。为满足日益增长的非人灵长类实验动物资源的需要，获得准确、可靠、重复性好的实验结果，排除实验动物本身对实验研究的影响，使用遗传背景清晰的标准化实验动物是必要条件。目前国家标准及地方标准对于封闭群非人灵长类实验动物(如恒河猴)尚未制定遗传监测方法。

2、短串联重复(short tandem repeat，str)是基因组中重要的一种重复序列，呈孟德尔式共显性遗传，在基因组中数量大、分布广、多态性丰富，且哺乳动物的str位点具有高度的保守性。str标记与其他遗传标记物相比，str基因座片段小、容易扩增，更适用于微量和降解检材，且多个str基因座可以同时进行复合扩增，具有快速、高效、准确、灵敏、信息量大等优点。作为分子遗传标记，str广泛地应用于物种鉴定、个体识别、亲子鉴定等诸多领域。经研究报道发现，str在实验恒河猴遗传监测方面也发挥着重要作用。

3、目前dna分型检测主要采用毛细管电泳(capillary electrophoresis，ce)技术，通过检测带有不同荧光基团的扩增片段长度而得到基因分型，这种方法易导致str位点的一些杂合基因的碱基序列不同而长度相同被判为纯合。并且毛细管电泳法采用多荧光复合扩增技术，设计引物时一些位点会保留较长的侧翼序列，导致扩增产物长，不利于检材的分型。通常一次只能检测少量样本的数十个位点，当遇到复杂亲缘关系鉴定时，则往往还需联合使用多种试剂盒以增加检测效能，这时就会出现操作过程繁琐、模板需求量较大的问题，若检材质量较差还可能出现大片段的丢失。同时这种方法仅限于人们已经研究过的基因序列，不能反映基因组的全貌。因此，利用毛细管电泳的一代str分型技术难以处理诸如复杂的亲缘关系鉴定或者混合复杂的样本等。

4、近年来逐渐发展成熟的二代测序技术(next generation sequencing，ngs)，可以同时在一个反应内完成数十万到数百万条dna分子片段的序列测定，具有高测序深度、高并行性和高准确性的特点，能够精确分析各位点的序列差异，充分地挖掘有效的遗传信息，可以实现规模化测序。并且ngs对各位点的长度没有限制，所以可以设计适当短的核酸片段，有利于降解检材的精确分型检测，现已成为实验动物遗传监测中很有前途的一种方法，其能容纳的遗传标记数量更多、对等位基因的区分效能更高，更有助于亲缘关系的鉴定。

5、因此，研发基于ngs的实验恒河猴str遗传标记检测试剂盒，减少操作步骤，节省实验时间，只需一次扩增就能获得实验恒河猴常染色体上的遗传信息，为实验恒河猴遗传监测方法提供相应技术支撑，对了解实验恒河猴的遗传背景，规模化开发实验动物产业具有重要意义。

技术实现思路

1、目前国内外关于使用二代测序技术大规模检测实验恒河猴遗传信息的研究尚少，少数报道使用二代测序技术检测以str/snp作为遗传标记的食蟹猴的遗传关系，大部分报道使用荧光标记pcr—毛细管电泳法检测实验恒河猴str遗传标记信息。由于食蟹猴和恒河猴属于不同种，且形态特征、栖息环境、生活习性等均不相同，因此基于二代测序技术建立的用于食蟹猴遗传关系鉴定的方法无法和本提案建立的方法相比较。传统方法使用荧光标记pcr—毛细管电泳法检测实验动物的遗传信息，这种方法通过检测带有不同荧光基团的扩增片段长度而得到基因分型，易导致str位点的一些杂合基因的碱基序列不同而长度相同被判为纯合。并且毛细管电泳法采用多荧光复合扩增技术，设计引物时一些位点会保留较长的侧翼序列，导致扩增产物长，不利于检材的分型。通常一次只能检测少量样本的数十个位点，当遇到复杂亲缘关系鉴定时，则往往还需联合使用多种试剂盒以增加检测效能，这时就会出现操作过程繁琐、模板需求量较大的问题，若检材质量较差还可能出现大片段的丢失。同时这种方法仅限于人们已经研究过的基因序列，不能反映基因组的全貌。因此，利用毛细管电泳的一代str分型技术难以处理诸如复杂的亲缘关系鉴定或者混合复杂的样本等。另外，现有市面上尚未有关于非人灵长类实验动物str遗传标记检测试剂盒的报道。有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于ngs的实验恒河猴str遗传标记检测试剂盒及应用，拟解决如下问题：

2、(1)现有市面上暂无实验恒河猴str遗传标记检测试剂盒，无法大批量、快速、高效、准确对实验恒河猴进行遗传信息检测，而本发明意在筛选一组适宜实验恒河猴遗传多态性分析的str遗传标记，应用二代测序技术，研发一个适用于实验恒河猴的有效的遗传检测试剂盒，从而对实验恒河猴谱系及遗传多态性进行分析，对现有繁育方式作出评价，从分子遗传角度指导实验恒河猴群体开展合理、科学的遗传繁育；

3、(2)克服现有技术的不足，实现在单管内同时扩增、检测实验恒河猴19个str基因座，且在基因座排布中尽量使各基因座分布于不同染色体上、相互之间不存在遗传连锁；确保在扩增过程中各条引物之间相互无干扰，无非特异峰产生，从而满足实验恒河猴的谱系鉴定、个体识别及性别辨别等多种需求。

4、为实现上述目的，本发明的技术方案是：

5、一种实验恒河猴str遗传标记组合，其包括以下19个实验恒河猴str遗传标记：d10s611、d11s2002、d13s765、d15s823、d18s537、d1s548、d3s1768、d4s2365、d5s1457、d6s1691、d6s2741、d6s276、d6s2883、d6s291、d6s2972、d6s501、d7s794、d8s1106和d9s921。

6、用于检测上述19个实验恒河猴str遗传标记的引物组，所述引物组包括seq idno：1～38所示的引物。

7、用于检测上述19个实验恒河猴str遗传标记的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物组。

8、一种基于ngs的对实验恒河猴str遗传标记进行检测的方法，包括以下步骤：

9、1)提取待检测实验恒河猴个体的dna作为模板；

10、2)使用seq id no：1～38所示的引物进行第一轮pcr扩增反应；以第一轮pcr扩增产物为模板，利用带有index序列的引物，通过第二轮pcr扩增向文库末端引入和illumina平台兼容的特异性标签序列；

11、3)对第二轮pcr产物进行ngs测序及基因型判定。

12、进一步的，上述提取实验恒河猴的dna：是采集实验恒河猴的血液。

13、进一步的，上述第一轮pcr扩增的反应程序为：95℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；4℃彻底延伸。

14、进一步的，上述第一轮pcr扩增的反应体系总体积为50μl：扩增预混液9μl，dna聚合酶0.25μl，引物混合液2μl，模板dna2.5μl，其余为去离子水。

15、优选的，在第一轮pcr扩增的反应体系中，如seq id no：1～2、seq id no：5～6、seq id no：11～24、seq id no：27～32、seq id no：35～38所示的引物在扩增体系中的终浓度为0.1μm，如seq id no：3～4、seq id no：25～26所示的引物在扩增体系中的终浓度为0.15μm，如seq id no：9～10、seq id no：33～34所示的引物在扩增体系中的终浓度为0.05μm，如seq id no：7～8所示的引物在扩增体系中的终浓度为2μm。

16、上述的实验恒河猴str遗传标记组合、引物组、方法在用于实验恒河猴的个体识别、谱系鉴定、亲缘鉴定方面的应用。

17、本发明的显著优点在于：

18、1)本发明所述借助多重pcr技术，利用二代平台超高通量优势，能够在单管中同时扩增、检测19个实验恒河猴的str位点，可以对几十个str位点和上千个样本同时检测，增加了实验的通量；通过生信分析基于序列进行str的准确分型，提高了str分型准确性。整个过程快速、准确，缩短了实验周期，并节约了实验成本，同时也解决了多倍体进行准确str分型的困难。

19、2)本发明选用的基因座尽量分布在不同染色体上，相互之间不存在遗传连锁，从而提高了试剂盒的整体识别能力；

20、3)本发明所述特异性扩增引物之间相互无干扰，无非特异峰产生，且具有特异性强、分辨率高、分型准确、灵敏度高等特点，可完全满足实验恒河猴谱系鉴定、亲缘关系鉴定、个体识别等多方面需求。