本发明涉及癌症免疫疗法的领域。具体而言，本发明提供获得tcr的方法、肿瘤特异性tcr、经工程改造的免疫细胞、药物组合物、以及用于治疗癌症的试剂盒。
背景技术：
：：1、与血液性癌症不同，实体肿瘤缺乏由一般嵌合抗原受体(chimeric antigenreceptor,car)识别的细胞表面抗原。来自实体肿瘤的细胞内抗原必须通过hla分子以hla-抗原表位复合物呈现在细胞表面上，此类hla-抗原表位复合物是由肿瘤特异性t细胞表面上的t细胞受体(t cell receptor,tcr)特异性识别，从而由肿瘤特异性t细胞引发抗肿瘤细胞毒性。2、在2018年2月前，有75项关于过继(adoptive)免疫细胞的临床试验，此类过继免疫细胞经工程改造而具有肿瘤特异性tcr，以用于治疗癌症。靶标包括肿瘤相关抗原、肿瘤相关病毒抗原、以及新抗原。适应症包括许多常见类型的实体肿瘤。目前在临床试验中的tcr-t细胞的示例包括靶向wt1/hla-a*0201复合物的tcr-t(juno therapeutics)，其是用于治疗急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia,aml)和非小细胞肺癌；靶向mage-a3/a6/hla-dpb1*0401复合物的tcr-t(kite)，其是用于治疗恶性实体肿瘤；以及靶向mage-a4/hla-a*0201的tcr-t(adaptimmune)，其是用于治疗恶性实体肿瘤。3、在本文中所参照的所有出版物、专利、专利申请案、以及已公开专利申请案的公开内容全文特此以引用方式并入本文中。技术实现思路1、本发明提供方法、组合物、以及试剂盒以用于获得一种或多种特异性识别来自个体的肿瘤抗原肽的t细胞受体(tcr)，该个体已在临床上受益于免疫疗法，诸如多抗原特异性细胞疗法(multiple antigen specific cell therapy，“masct”)。2、本专利申请的一个方面提供一种获得多种特异性识别目标肿瘤抗原肽的t细胞受体(tcr)的方法，其包括：a)第一共培养步骤，其包括将载有该目标肿瘤抗原肽的第一树突细胞(dendritic cell,dc)群与来自个体的t细胞群共培养，以获得第一共培养物；b)富集步骤，其包括使该第一共培养物经受富集过程，以获得经富集的活化t细胞；c)第二共培养步骤，其包括将此类经富集的活化t细胞与载有该目标肿瘤抗原肽的第二dc群共培养，以获得肿瘤抗原特异性t细胞群，其中至少约10％的此类肿瘤抗原特异性t细胞对该目标肿瘤抗原肽有特异性反应；以及d)测序步骤，其包括使此类肿瘤抗原特异性t细胞经受下一代测序，以识别多对编码tcrα和tcrβ的基因，从而基于编码tcrα和tcrβ的成对基因来提供该多种t细胞受体；其中该个体已在临床上受益于多抗原特异性细胞疗法(masct)，该masct包括向该个体施用有效量的活化t细胞，此类活化t细胞是通过将t细胞群与载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养而制备，该多种肿瘤抗原肽包括该目标肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，该第一共培养步骤是在该富集步骤之前进行约1至约3天。在一些实施方案中，该t细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的该第一dc群之间的比率不大于约30:1(诸如约10:1至约20:1、或约15:1、或约20:1)。在一些实施方案中，在该第一共培养步骤中的该t细胞群存在于pbmc中。在一些实施方案中，载有该目标肿瘤抗原肽的该第一dc群与该t细胞群是在第一共培养基中共培养，该第一共培养基包含一种或多种细胞因子(例如，il-2或多种细胞因子)以及免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，该第一共培养基包含il-2、il-7、il-15、以及il-21、以及抗pd-1抗体。在一些实施方案中，该第一共培养基包含il-2和抗pd-1抗体。3、在一些根据上述方法中任一者的实施方案中，该富集步骤包括：使该第一共培养物与载有该目标肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞(antigen presenting cell,apc)接触，以获得经刺激的共培养物；以及使用配体自该经刺激的共培养物分离经富集的活化t细胞群，该配体特异性识别细胞因子。在一些实施方案中，该细胞因子为ifnγ。在一些实施方案中，该经富集的活化t细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的该第二dc群之间的比率为约1:1至约20:1。在一些实施方案中，将该经富集的活化t细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的该第二dc群共培养约12至25天。4、在一些根据上述方法中任一者的实施方案中，该第二共培养步骤包括：在初始第二共培养基中将载有该目标肿瘤抗原肽的该第二dc群与该经富集的活化t细胞群共培养，以提供第二共培养物，该初始第二共培养基包含免疫检查点抑制剂和可选地一种或多种细胞因子(例如，il-2或多种细胞因子)；以及将抗cd3抗体(例如，okt3)和可选地一种或多种细胞因子(例如，il-2或多种细胞因子)添加至该第二共培养物，以获得肿瘤抗原特异性t细胞群。在一些实施方案中，在该第二共培养步骤开始后不多于约3天，将该抗cd3抗体添加至该第二共培养物。在一些实施方案中，该抗cd3抗体是okt3。在一些实施方案中，在该第二共培养步骤开始后不多于约3天(例如，约2天)，将该一种或多种细胞因子添加至该第二共培养物。在一些实施方案中，该一种或细胞因子包括il-2。在一些实施方案中，该免疫检查点抑制剂是抗pd-1抗体(例如，shr-1210)。在一些实施方案中，该初始第二共培养基包含il-2、il-7、il-15、以及il-21、以及抗pd-1抗体。5、在一些根据上述方法中任一者的实施方案中，该方法进一步包括第三共培养步骤，该第三共培养步骤包括将此类肿瘤抗原特异性t细胞的群与载有目标肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞(apc)的群共培养，以获得第二肿瘤抗原特异性t细胞群，其中使该第二肿瘤抗原特异性t细胞群在该测序步骤中经受下一代测序。在一些实施方案中，此类apc是pbmc、dc、或细胞系apc。在一些实施方案中，该肿瘤抗原特异性t细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的apc群之间的比率为约1:1至约20:1。在一些实施方案中，将该肿瘤抗原特异性t细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的apc群共培养约5至9天。在一些实施方案中，该肿瘤抗原特异性t细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的apc群是在第三共培养基中共培养，该第三共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如il-2或多种细胞因子)和抗cd3抗体。在一些实施方案中，该第三共培养基包含il-2、il-7、il-15、以及okt3。在一些实施方案中，该第三共培养基包含il-2和okt3。在一些实施方案中，重复该第三共培养步骤(例如，一次、两次、或三次)。6、在一些根据上述方法中任一者的实施方案中，该多种肿瘤抗原肽是多种合成肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，该多种肿瘤抗原肽不是获自细胞样本。7、在一些根据上述方法中任一者的实施方案中，该多种肿瘤抗原肽包括(多种)一般肿瘤抗原肽、(多种)癌症类型特异性抗原肽、和/或新抗原肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括一种或多种新抗原肽。在一些实施方案中，该多种肿瘤抗原肽包括新抗原肽(例如，由新抗原肽组成)。在一些实施方案中，该多种肿瘤抗原肽包括至少约5种(例如，至少约10、20、30、40、或更多种)不同肿瘤抗原肽。8、在一些根据上述方法中任一者的实施方案中，该目标肿瘤抗原肽是衍生自选自下列的肿瘤抗原：htert、p53、存活素(survivin)、ny-eso-1、cea、ccnd1、rgs5、mmp7、vegfr1、vegfr2、muc1、her2、mage-a1、mage-a3、cdca1、wt1、kras、parp4、mll3、mthfr、hpv16-e6、hpv16-e7、hpv18-e6、hpv18-e7、hpv58-e6、hpv58-e7、hbcag、hbv聚合酶、gpc3、ssx、以及afp。9、在一些根据上述方法中任一者的实施方案中，该方法进一步包括：识别来自该目标肿瘤抗原肽的目标肿瘤表位，其中该目标肿瘤表位引发该经富集的活化t细胞群的特异性反应；以及使apc群与该目标肿瘤表位接触，以获得载有该目标肿瘤抗原肽的apc群。10、在一些根据上述方法中任一者的实施方案中，该下一代测序是单细胞测序。在一些实施方案中，该下一代测序是批量测序(bulk sequencing)。在一些实施方案中，该测序步骤包括对此类肿瘤抗原特异性t细胞的批量样本进行测序、以及对多个肿瘤抗原特异性t细胞进行单细胞测序。在一些实施方案中，该测序步骤包括此类肿瘤抗原特异性t细胞的第一部分的批量测序，以提供多个编码tcrα和tcrβ的基因；以及此类肿瘤抗原特异性t细胞的第二部分的单细胞测序，其提供该多个编码tcrα和tcrβ的基因的同源配对信息，从而基于编码tcrα和tcrβ的成对基因来提供多种tcr。在一些实施方案中，在该下一代测序之前，将此类肿瘤抗原特异性t细胞用载有该目标肿瘤抗原肽的apc刺激。11、在一些根据上述方法中任一者的实施方案中，在接受该masct后，该个体具有部分反应(partial response,pr)、完全反应(complete response,cr)、或疾病稳定(stabledisease,sd)。在一些实施方案中，该masct包括：将载有多种肿瘤抗原肽的dc群与t细胞群共培养，以获得活化t细胞群，该多种肿瘤抗原肽包括该目标肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，该masct包括：(i)在初始共培养基中将载有多种肿瘤抗原肽的dc群与t细胞群共培养，以提供共培养物，该多种肿瘤抗原肽包括该目标肿瘤抗原肽，该初始共培养基包含一种或多种(例如，多种细胞因子)以及免疫检查点抑制剂；以及(ii)在该共培养开始后约3至7天，将抗cd3抗体添加至该共培养物，从而获得该活化t细胞群。在一些实施方案中，该masct包括：(i)使dc群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有该多种肿瘤抗原肽的dc群，该多种肿瘤抗原肽包括该目标肿瘤抗原肽；以及(ii)在dc成熟培养基中培养载有该多种肿瘤抗原肽的该dc群，该dc成熟培养基包含mpla。在一些实施方案中，该dc成熟培养基包含infγ、mpla、以及pge2。在一些实施方案中，该masct包括向该个体施用有效量的载有该多种肿瘤抗原肽的dc。在一些实施方案中，该个体先前已接受该masct至少三次。12、在一些根据上述方法中任一者的实施方案中，同时获得特异性识别多种目标肿瘤抗原肽的tcr。13、在一些根据上述方法中任一者的实施方案中，该方法进一步包括：在宿主免疫细胞中表达各对编码tcrα和tcrβ的基因，以提供表达tcr的经工程改造的免疫细胞；以及评估该经工程改造的免疫细胞对该目标肿瘤抗原肽的反应。进一步提供的是一种使用上述方法获得特异性识别目标肿瘤抗原肽的tcr的方法，其中基于表达该tcr的该经工程改造的免疫细胞对该目标肿瘤抗原肽的该反应来选择该tcr。在一些实施方案中，该方法进一步包括确定该tcr的hla限制。在一些实施方案中，该tcr具有亚洲人中主要的hla单倍型(haplotype)限制。在一些实施方案中，该方法进一步包括该tcr的亲和力成熟。在一些实施方案中，该方法进一步包括增强该tcr中的tcrα链和tcrβ链的配对。在一些实施方案中，该方法进一步包括增强该tcr的该表达。在一些实施方案中，该目标肿瘤抗原肽是衍生自cea、rsg-5、或hpv18-e7。14、还提供的是一种肿瘤特异性tcr，其是使用上述方法中任一者获得。15、本专利申请的另一个方面提供一种肿瘤特异性tcr，其包括：(a)包括互补决定区(cdr)3的tcrα链，该cdr3与seq id no:4、10、以及16的氨基酸序列中任一者具有至少约90％序列同一性；以及包括cdr3的tcrβ链，该cdr3包括与seq id no:7、13、以及19的氨基酸序列中任一者具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列；(b)包括互补决定区(cdr)3的tcrα链，该cdr3与seq id no:22、28、34、40、46、以及52的氨基酸序列中任一者具有至少约90％序列同一性；以及包括cdr3的tcrβ链，该cdr3包括与seq id no:7、13、19、25、31、37、43、49、以及55的氨基酸序列中任一者具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列；或(c)包括互补决定区(cdr)3的tcrα链，该cdr3与seq id no:58、64、70、76、87、以及93的氨基酸序列中任一者具有至少约90％序列同一性；以及包括cdr3的tcrβ链，该cdr3包括与seq id no:61、67、73、79、90、以及96的氨基酸序列中任一者具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列。16、在一些实施方案中，该肿瘤特异性tcr包括：(a)包括cdr3的tcrα链，该cdr3包括seq id no:4的氨基酸序列；以及包括cdr3的tcrβ链，该cdr3包括seq id no:7的氨基酸序列；(b)包括cdr3的tcrα链，该cdr3包括seq id no:10的氨基酸序列；以及包括cdr3的tcrβ链，该cdr3包括seq id no:13的氨基酸序列；(c)包括cdr3的tcrα链，该cdr3包括seq idno:16的氨基酸序列；以及包括cdr3的tcrβ链，该cdr3包括seq id no:19的氨基酸序列；(d)包括cdr3的tcrα链，该cdr3包括seq id no:22的氨基酸序列；以及包括cdr3的tcrβ链，该cdr3包括seq id no:25的氨基酸序列；(e)包括cdr3的tcrα链，该cdr3包括seq id no:28的氨基酸序列；以及包括cdr3的tcrβ链，该cdr3包括seq id no:31的氨基酸序列；(f)包括cdr3的tcrα链，该cdr3包括seq id no:34的氨基酸序列；以及包括cdr3的tcrβ链，该cdr3包括seq id no:37的氨基酸序列；(g)包括cdr3的tcrα链，该cdr3包括seq id no:40的氨基酸序列；以及包括cdr3的tcrβ链，该cdr3包括seq id no:43的氨基酸序列；(h)包括cdr3的tcrα链，该cdr3包括seq id no:46的氨基酸序列；以及包括cdr3的tcrβ链，该cdr3包括seq idno:49的氨基酸序列；(i)包括cdr3的tcrα链，该cdr3包括seq id no:52的氨基酸序列；以及包括cdr3的tcrβ链，该cdr3包括seq id no:55的氨基酸序列；(j)包括cdr3的tcrα链，该cdr3包括seq id no:58的氨基酸序列；以及包括cdr3的tcrβ链，该cdr3包括seq id no:61的氨基酸序列；(k)包括cdr3的tcrα链，该cdr3包括seq id no:64的氨基酸序列；以及包括cdr3的tcrβ链，该cdr3包括seq id no:67的氨基酸序列；(l)包括cdr3的tcrα链，该cdr3包括seq id no:70的氨基酸序列；以及包括cdr3的tcrβ链，该cdr3包括seq id no:73的氨基酸序列；(m)包括cdr3的tcrα链，该cdr3包括seq id no:76的氨基酸序列；以及包括cdr3的tcrβ链，该cdr3包括seq id no:79的氨基酸序列；(n)包括cdr3的tcrα链，该cdr3包括seqid no:87的氨基酸序列；以及包括cdr3的tcrβ链，该cdr3包括seq id no:90的氨基酸序列；或(o)包括cdr3的tcrα链，该cdr3包括seq id no:93的氨基酸序列；以及包括cdr3的tcrβ链，该cdr3包括seq id no:96的氨基酸序列。17、进一步提供的是一种肿瘤特异性tcr，其包括：(a)tcrα链，其包括seq id no:5、11、以及17的氨基酸序列中任一者的cdr；和tcrβ链，其包括seq id no:8、14、以及20的氨基酸序列中任一者的cdr；(b)tcrα链，其包括seq id no:23、29、35、41、47、以及53的氨基酸序列中任一者的cdr；和tcrβ链，其包括seq id no:26、32、38、44、50、以及56的氨基酸序列中任一者的cdr；或(c)tcrα链，其包括seq id no:59、65、71、77、88、以及94的氨基酸序列中任一者的cdr；和tcrβ链，其包括seq id no:62、68、74、80、91、以及97的氨基酸序列中任一者的cdr。18、在一些根据上述肿瘤特异性tcr中任一者的实施方案中，该肿瘤特异性tcr是人类tcr。在一些实施方案中，该肿瘤特异性tcr是嵌合tcr，诸如鼠源化(murinized)tcr，例如包括tcrα链和β链的鼠类恒定区的tcr。19、在一些根据上述肿瘤特异性tcr中任一者的实施方案中，该肿瘤特异性tcr包括：(a)tcrα链，其包括与seq id no:5、11、以及17的氨基酸序列中任一者具有至少约80％同一性的氨基酸序列；和tcrβ链，其包括与seq id no:8、14、以及20的氨基酸序列中任一者具有至少约80％同一性的氨基酸序列；(b)tcrα链，其包括与seq id no:23、29、35、41、47、以及53的氨基酸序列中任一者具有至少约80％同一性的氨基酸序列；和tcrβ链，其包括与seqid no:26、32、38、44、50、以及56的氨基酸序列中任一者具有至少约80％同一性的氨基酸序列；或(c)tcrα链，其包括与seq id no:59、65、71、77、88、以及94的氨基酸序列中任一者具有至少约80％同一性的氨基酸序列；和tcrβ链，其包括与seq id no:62、68、74、80、91、以及97的氨基酸序列中任一者具有至少约80％同一性的氨基酸序列。20、还提供的是一种分离核酸，其编码根据上述肿瘤特异性tcr中任一者的肿瘤特异性tcr的该tcrα链和/或该tcrβ链；一种载体，其包括该(等)分离核酸。21、本专利申请的一个方面提供一种经工程改造的免疫细胞，其包括上述根据肿瘤特异性tcr中任一者的肿瘤特异性tcr、分离核酸、或载体。22、在一些实施方案中，该免疫细胞是t细胞。在一些实施方案中，提供一种药物组合物，其包括根据上述经工程改造的免疫细胞中任一者的经工程改造的免疫细胞、以及药学上可接受的载体。23、在一些实施方案中，提供一种治疗个体中癌症的方法，其包括向该个体施用有效量的根据上述药物组合物中任一者的药物组合物。24、在一些实施方案中，提供一种肿瘤特异性tcr的库，此类肿瘤特异性tcr是使用根据上述方法中任一者的方法获得。25、进一步提供的是试剂盒、药物、以及制品，其包括如上所述的组合物(诸如分离核酸、载体、以及经工程改造的免疫细胞)中任一者。26、由随后的具体实施方式和随附权利要求书，本发明的这些及其他方面及优点将变得显而易见。应了解的是，本文所述的各种实施方案的一项、一些、或所有性质可经组合以形成本发明的其他实施方案。当前第1页12当前第1页12