三角帆蚌CypA基因的克隆及其应用

本发明属于生物基因工程，具体涉及一种三角帆蚌cypa基因的克隆及其应用。

背景技术：

1、亲环素家族(cyclophiins,cyps)是一类广泛分布于自然界、具有高度保守性的多功能蛋白家族，它们是免疫抑制剂环孢素a(cyclophilins,csa)细胞内受体又称为csa结合蛋白。当前，对cypa的研究主要集中于其在不同生物体内的分布、相关蛋白序列的分析、结构及其重要的生物学功能等领域的研究。诸多研究结果显示cypa与肿瘤的发生密切相关。qian等通过rna干扰技术抑制cypa在非小细胞肺癌细胞中的表达，通过细胞增殖实验和克隆形成实验，发现cypa表达的下调导致了非小细胞肺癌细胞的增殖明显下降。运用蛋白质组学和细胞生物学的方法发现，cypa在食管鳞癌、男性乳腺癌、前列腺癌、头颈部肿瘤和舌鳞状细胞癌等肿瘤中的表达也明显上调，参与其恶性的生物学行为。相关研究报道，cypa的分子伴侣功能，对在形成肿瘤中不当的信号激活，造成的条件复合物的错误折叠和断裂的修复起着很重要的作用，并且维持蛋白的稳态，这很可能是肿瘤生存的关键。此外，cypa基因可作为一个免疫抑制剂参与病毒复制的中间过程，参与机体的免疫机制；研究还发现，哺乳动物中的cypa基因对抵御病毒感染起着重要的角色，表明cypa基因参与先天免疫机制。近年来研宄发现，cypa在栉孔扇贝、池蝶蚌以及中华绒螯蟹、斑节对虾、凡纳滨对虾、黄颡鱼、斑点叉尾鮰等水生生物中可能充当一种免疫应激的角色。

2、三角帆蚌(hyriopsis cumingii)属瓣鳃纲、蚌科、帆蚌属，是主要的淡水珍珠养殖蚌之一。三角帆蚌养殖不仅历史悠久、产量高，而且成珠质量细腻、光滑、色泽艳丽,形状圆。近年来随着三角帆蚌养殖业的迅猛发展，细菌、病毒、寄生虫等病原性因子引起养殖病害肆虐，高密度养殖导致水体富营养化等问题，使三角帆蚌养殖业遭受严重威胁，开展三角帆蚌免疫系统及其调节机制的研究对于三角帆蚌养殖的可持续发展具有重要意义。

3、嗜水气单胞菌感染是导致三角帆蚌大规模死亡的主要原因之一，其发病时间短和死亡率高，已成为三角帆蚌养殖产业绿色发展的重要制约因素。然而，三角帆蚌感染嗜水气单胞菌后，cypa基因在不同组织中的免疫应答规律尚不清楚。因此，本研究拟克隆获得三角帆蚌cypa基因cdna全长并进行序列分析，与其他的物种进行同源性序列比对，构建遗传系统进化树；通过实时荧光定量pcr(quantitativereal-timepcr，qpcr)检测三角帆蚌cypa基因在不同组织的表达；利用嗜水气单胞菌对三角帆蚌进行浸泡感染，研究cypa基因在不同组织表达的变化规律，以期为三角帆蚌的病害防控及抗感染机制的研究提供基础实验数据。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服上述现有技术的缺点，提供了一种三角帆蚌cypa基因的克隆及其应用。

2、技术思路：克隆获得三角帆蚌cypa基因cdna全长并进行序列分析，与其他的物种进行同源性序列比对，构建遗传系统进化树；通过实时荧光定量pcr(quantitativereal-timepcr，qpcr)检测三角帆蚌cypa基因在不同组织的表达；利用嗜水气单胞菌对三角帆蚌进行浸泡感染，研究cypa基因在不同组织表达的变化规律。

3、基于上述技术思路，本发明采用的技术方案为：

4、本发明的一种技术方案是三角帆蚌cypa基因的克隆，包括以下步骤：

5、步骤1：提取总rna作为模板，利用simgen反转录试剂盒进行反转录，所得cdna保存于-20℃备用；

6、步骤2：利用premier5.0软件，根据ncbi中已知蚌科的池蝶蚌cypa基因cdna序列，设计引物cypa-f，cypa-r；

7、步骤3：以步骤1获得的三角帆蚌肝脏总cdna为模板进行cypa基因中间序列的扩增，将扩增产物回收纯化，经链接、转化以及菌液pcr鉴定后，送湖南擎科测序；

8、步骤4：根据测序获得的三角帆蚌cypa基因中间序列设计5’和3’race引物；

9、步骤5：以三角帆蚌肝脏总rna为模板，使用race试剂盒扩增三角帆蚌cypa基因两端序列；

10、步骤6：pcr产物经回收纯化后与linerariedprace载体连接，转化到感受态大肠杆菌dh5α株，经选择培养基筛选及菌液pcr鉴定，然后进行测序；

11、步骤7：将已获得的cdna片段拼接并进行序列分析与比对，以获得三角帆蚌cypa基因全长cdna序列。

12、在上述技术方案中，所述的cypa-f和cypa-r引物序列如下：

13、cypa-f：5’-gaaagccgtcaggcagaata-3’；

14、cypa-r：5’-tagagcaaatgggaataact-3’。

15、在上述技术方案中，步骤3中的pcr反应条件：94℃，5min；94℃，30s，54℃，30s，72℃，1min，循环30次；72℃，10min，4℃终止。

16、在上述技术方案中，所述的5’和3’race引物序列如下：

17、3’gsp：gattacgccaagcttttaataaaggaggtgaacagaatcc；

18、5’gsp：gattacgccaagcttctgagccattcttctcactt。

19、在上述技术方案中，步骤5中的扩增条件为：94℃，5min；94，30s，72℃，3min，循环5次；94℃，30s，70℃，30s，72℃，3min，循环5次；94℃，30s，68℃，30s，72℃，3min，循环25次；72℃延伸8min，4℃终止。

20、在上述技术方案中，所述的cypa基因的三级结构中含有8股反向平行的β折叠和2个α螺旋，且phe48～gly65位的氨基酸序列形成一个发散环样结构。

21、在上述技术方案中，进一步地，所述的phe48～gly65位的氨基酸序列为：—fkgsafhriipgfmcqgg—。

22、本发明另一技术方案是三角帆蚌cypa基因在三角帆蚌病害防控组合物或细菌感染防御组合物中的应用。

23、在上述技术方案中，所述的组合物由活性成分和助剂制成养殖业上可接受的助剂或载体，所述活性成分包括三角帆蚌cypa基因。

24、本发明又一技术方案是提供一种嗜水气单胞菌致病基因检测试剂盒，该试剂盒包括三角帆蚌cypa基因荧光定量pcr引物，其引物序列如下表所示：

25、

26、本发明的有益效果：

27、本发明合成了三角帆蚌cypa基因经过序列分析与比对，cypa在性腺中具有防御细菌感染的特别的作用，在性腺成熟后，性腺可能不仅仅行使生殖功能的角色，在免疫方面也承担一定的功能，其参与了无脊椎动物对外源微生物刺激的免疫防御。

技术特征：

1.三角帆蚌cypa基因的克隆，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的三角帆蚌cypa基因的克隆，其特征在于，所述的cypa-f和cypa-r引物序列如下：

3.根据权利要求1所述的三角帆蚌cypa基因的克隆，其特征在于，在步骤3中，pcr反应条件：94℃，5min；94℃，30s，54℃，30s，72℃，1min，循环30次；72℃，10min，4℃终止。

4.根据权利要求1所述的三角帆蚌cypa基因的克隆，其特征在于，所述的5’和3’race引物序列如下：

5.根据权利要求1所述的三角帆蚌cypa基因的克隆，其特征在于，在步骤5中，扩增条件为：扩增条件为：94℃，5min；94，30s，72℃，3min，循环5次；94℃，30s，70℃，30s，72℃，3min，循环5次；94℃，30s，68℃，30s，72℃，3min，循环25次；72℃延伸8min，4℃终止。

6.根据权利要求1所述的三角帆蚌cypa基因的克隆，其特征在于，所述的cypa基因的三级结构中含有8股反向平行的β折叠和2个α螺旋，且phe48～gly65位的氨基酸序列形成一个发散环样结构。

7.根据权利要求6所述的三角帆蚌cypa基因的克隆，其特征在于，所述的phe48～gly65位的氨基酸序列为：—fkgsafhriipgfmcqgg—。

8.三角帆蚌cypa基因在制备三角帆蚌病害防控组合物或细菌感染防御组合物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的组合物由活性成分和助剂制成养殖业上可接受的助剂或载体，所述活性成分包括三角帆蚌cypa基因。

10.一种嗜水气单胞菌致病基因检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括三角帆蚌cypa基因荧光定量pcr引物，其引物序列如下表所示：

技术总结
本发明提供了一种三角帆蚌CypA基因克隆方法及其应用，并进行序列分析，与其他的物种进行同源性序列比对，构建遗传系统进化树；通过实时荧光定量PCR(QuantitativeReal‑timePCR，qPCR)检测三角帆蚌CypA基因在不同组织的表达；利用嗜水气单胞菌对三角帆蚌进行浸泡感染，研究CypA基因在不同组织表达的变化规律，为三角帆蚌的病害防控及抗感染机制的研究提供基础实验数据。

技术研发人员：夏虎,杨品红,李超群
受保护的技术使用者：湖南文理学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13