一种固定化蛋白酶及其制备方法和应用与流程

本发明属于蛋白酶，具体涉及一种固定化蛋白酶及其制备方法和应用。

背景技术：

1、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶是催化肽键水解的一类酶，它广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中，是全球市场上开发最多的酶类。中性蛋白酶具有催化速率高、作用条件温和等特点，被广泛应用在皮革脱毛、软化、羊毛丝绸脱胶、洗涤剂、饲料、酿酒酿造、医药、化工、食品、废弃物处理等领域。目前全球蛋白酶的总需求可占酶制剂类产品总需求的40％，已报道发现的中性蛋白酶类有3000多种，但其中已实现大规模工业化生产的只有60多种。

2、制革工业是我国的传统产业之一，具有悠久的历史，但也是轻工行业的污染大户。其中脱毛排放的污染物可占整个制革过程排污量的80-90％，其原因在于目前皮革企业普遍采用灰碱法脱毛，由于硫化物和石灰的使用，使排放的废水含有大量s2-、有机物、固体悬浮物、碱性污泥等。随着我国环保要求不断提高，寻求绿色环保的替代方法成为企业迫切的需求。酶制剂作为绿色环保的催化剂，在工业生产中使用既能满足法规要求，又能满足客户对清洁技术和清洁、可持续生产方法的需求，从而降低对环境的影响。在20世纪60年代，我国就筛选出as 1.398中性蛋白酶和3942碱性蛋白酶用于皮革脱毛。但由于酶对温度和ph敏感，易受外界环境影响而失活，对设备和操作要求相对严格，并且脱毛时使用的粗酶液中还含有胶原蛋白酶，易产生松面、烂面等现象，影响皮革品质；并且与化学法相比酶法脱毛成本更高，限制了其大规模的推广。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种固定化蛋白酶及其制备方法和应用，制备可用于皮革脱毛的固定化蛋白酶，实现皮革脱毛环节的连续化和自动化，降低酶法脱毛成本。

2、本发明提供了一种固定化蛋白酶的制备方法，包括以下步骤：(1)将壳聚糖和乙酸与cacl2混合，得含有氯化钙的壳聚糖溶液；

3、(2)将海藻酸钠逐滴滴加到含有氯化钙的壳聚糖溶液中，搅拌，形成2-3mm的光滑小球后硬化，清洗并干燥，得微球；

4、(3)将所述微球与戊二醛共价结合，将共价结合后的微球与中性蛋白酶振荡固定，清洗并干燥，得固定化蛋白酶。

5、优选的，步骤(1)中，将100kda壳聚糖按照质量比1-3％溶于1-5％的乙酸溶液中，再添加终浓度为1-3％的cacl2。

6、优选的，步骤(2)中，将质量浓度为1-3％的海藻酸钠溶液逐滴滴入含有氯化钙的壳聚糖溶液中，置于磁力搅拌器按照20r/min转速搅拌。

7、优选的，步骤(2)所述清洗并干燥，包括将光滑小球置于4℃下硬化1h，用去离子水清洗去除凝胶表面的离子，抽滤除去表面水分后用滤纸吸干水分，置4℃备用。

8、优选的，步骤(3)中，将所述微球按照1:10的质量比例添加1-5％的戊二醛5-30℃共价结合过夜，用去离子水清洗去除凝胶表面的离子，抽滤除去表面水分后用滤纸吸干水分，置于4℃备用。

9、优选的，步骤(3)中，将共价结合后的微球按照1:10的质量比例添加中性蛋白酶液体10-40℃振荡过夜，用去离子水清洗去除凝胶表面的离子，抽滤除去表面水分后用滤纸吸干水分。

10、优选的，所述中性蛋白酶包括jw-3蛋白酶。

11、本发明的第二个目的在于提供利用上述制备方法制备得到的固定化蛋白酶。

12、本发明的另一个目的在于提供上述固定化蛋白酶在脱毛中的应用。

13、有益效果：固定化酶技术是指通过物理或者化学作用使酶分子负载于某一载体上，从而改变生物酶的一些特点和性质。固定化酶相比传统游离酶相比具有易分离、ph和温度耐受性增强、可反复利用实现连续生产等优点。壳聚糖是一种天然、可再生、可生物降解并且价格较低的固定化天然高分子材料。由于其表面存在氨基(-nh3)和羟基(-oh)两个官能团，很容易被修饰与酶分子形成共价键。本发明以实验室前期构建的一株脱毛用工程菌wb800n/pht43-npr，(在文章一种新型蛋白酶的酶学特征及脱毛应用中进行公开，并承诺自申请日其20年内向公众发放)其发酵生产的中性蛋白酶(jw-3)为研究对象，以壳聚糖、海藻酸钠为固定化载体，戊二醛为交联剂，制备可用于皮革脱毛的固定化蛋白酶，实现皮革脱毛环节的连续化和自动化，降低酶法脱毛成本，推动酶制剂在制革业的应用。

技术特征：

1.一种固定化蛋白酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将壳聚糖和乙酸与cacl2混合，得含有氯化钙的壳聚糖溶液；

2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤(1)中，将100kda壳聚糖按照质量比1-3％溶于1-5％的乙酸溶液中，再添加终浓度为1-3％的cacl2。

3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤(2)中，将质量浓度为1-3％的海藻酸钠溶液逐滴滴入含有氯化钙的壳聚糖溶液中，置于磁力搅拌器按照20r/min转速搅拌。

4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤(2)所述清洗并干燥，包括将光滑小球置于4℃下硬化1h，用去离子水清洗去除凝胶表面的离子，抽滤除去表面水分后用滤纸吸干水分，置4℃备用。

5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤(3)中，将所述微球按照1:10的质量比添加1-5％的戊二醛5-30℃共价结合过夜，用去离子水清洗去除凝胶表面的离子，抽滤除去表面水分后用滤纸吸干水分，置于4℃备用。

6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤(3)中，将共价结合后的微球按照1:10的质量比添加中性蛋白酶液体10-40℃振荡过夜，用去离子水清洗去除凝胶表面的离子，抽滤除去表面水分后用滤纸吸干水分。

7.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述中性蛋白酶包括jw-3蛋白酶。

8.利用权利要求1～7任一项所述制备方法制备得到的固定化蛋白酶。

9.权利要求8所述固定化蛋白酶在脱毛中的应用。

技术总结
本发明属于蛋白酶技术领域，具体涉及一种固定化蛋白酶及其制备方法和应用。本发明以壳聚糖、海藻酸钠为固定化载体，戊二醛为交联剂，制备可用于皮革脱毛的固定化蛋白酶，实现皮革脱毛环节的连续化和自动化，降低酶法脱毛成本，推动酶制剂在制革业的应用。

技术研发人员：吴芳彤,王力源,秦梦,赵露,郑翔,曹倩荣,刘春卯,秦艳梅,马清河
受保护的技术使用者：河北省微生物研究所有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12