rRNA探针及其制备方法和应用与流程

本申请涉及生物，尤其涉及一种rrna探针及其制备方法和应用。

背景技术：

1、生物样本提取的总rna（ribonucleicacid，核糖核酸）中含有大量的核糖体rna（rrna）序列，在进行全转录组测序建库过程中，需要将这些冗余的rrna序列去除掉，提高数据利用效率。现有方法主要包括生物素耦联的探针抓取法和探针辅助的rnase h（核糖核酸酶h）消化法，然而这两种方法均涉及生物素等修饰的捕获探针的合成，成本较高，并且操作步骤多、耗时长。

技术实现思路

1、本申请的主要目的在于提供一种rrna探针及其制备方法和应用，旨在解决现有技术去除总rna中的rrna成本较高且操作繁杂的技术问题。

2、为实现上述目的，本申请提供一种rrna探针的制备方法，所述rrna探针的制备方法包括以下步骤：

3、从人源细胞中提取总rna，基于所述总rna合成cdna；

4、分别使用预先设计的引物组，以所述cdna为模板进行pcr扩增，得到扩增产物；

5、分别将各所述扩增产物变性成单链dna；

6、分别对各所述单链dna进行环化处理，得到环化dna；

7、分别向各所述环化dna中加入dna聚合酶和滚环扩增引物组，进行滚环扩增，得到rrna长探针；

8、对各所述rrna长探针进行超声打断，得到rrna探针片段；

9、将各所述rrna探针片段混合，得到rrna探针。

10、可选地，所述引物组由一条正向引物和一条反向引物组成，其中，正向引物5’端含有磷酸根修饰，每组所述引物组中的正向引物和反向引物的5’端有3-20 bp序列一致。

11、可选地，所述引物组包括18s引物组和28s引物组，所述18s引物组包括18s引物组1、18s引物组2和18s引物组3，所述28s引物组包括28s引物组1、28s引物组2、28s引物组3和28s引物组4，其中，

12、所述18s引物组1包括序列如seq id no.1和seqno.2所示的引物；

13、所述18s引物组2包括序列如seq id no.3和seqno.4所示的引物；

14、所述18s引物组3包括序列如seq id no.5和seqno.6所示的引物；

15、所述28s引物组1包括序列如seq id no.7和seqid no.8所示的引物；

16、所述28s引物组2包括序列如seq id no.8和seqid no.10所示的引物；

17、所述28s引物组3包括序列如seq id no.11和seqid no.12所示的引物；

18、所述28s引物组4包括序列如seq id no.13和seqid no.14所示的引物。

19、可选地，所述rrna探针片段包括18s rrna探针片段和28s rrna探针片段，所述将各所述rrna探针片段混合，得到rrna探针的步骤包括：

20、将所述18s rrna探针片段与所述28s rrna探针片段，按2.7:1的质量比进行混合，得到rrna探针。

21、可选地，所述滚环扩增引物组包括所述18s引物组对应的滚环扩增引物组1以及所述28s引物组对应的滚环扩增引物组2，其中，

22、所述滚环扩增引物组1包括序列如seq id no.15、seq id no.16和seq no.17所示的引物；

23、所述滚环扩增引物组2包括序列如seq id no.18、seq id no.19、seq id no.20、seqid no.21、seq id no.22、seq id no.23、seq id no.24、seq id no.25、seqid no.26、seq id no.27、seq id no.28和seq no.29所示的引物。

24、可选地，所述分别对各所述单链dna进行环化处理，得到环化dna的步骤包括：

25、向各所述单链dna中加入环化酶，进行环化处理，得到环化产物；

26、向各所述环化产物中加入核酸外切酶，进行线性消化，得到环化dna。

27、可选地，所述dna聚合酶为phi29 dna聚合酶。

28、进一步地，本申请还提供一种rrna去除方法，所述rrna去除方法应用如上所述的rrna探针捕获并去除样本rna中的rrna序列。

29、可选地，所述rrna去除方法包括以下步骤：

30、向样本rna中加入rrna探针，进行杂交，得到杂交产物；

31、在所述杂交产物中加入核糖核酸酶h，对所述杂交产物中的rrna进行特异性消化，得到第一消化产物；

32、在所述第一消化产物中加入脱氧核糖核酸酶i，对所述第一消化产物中的rrna探针进行特异性消化，得到第二消化产物；

33、通过磁珠纯化所述第二消化产物，得到去除rrna序列后的样本rna。

34、本申请提供了一种rrna探针及其制备方法和应用，所述rrna探针的制备方法包括步骤：从人源细胞中提取总rna，基于所述总rna合成cdna；分别使用预先设计的引物组，以所述cdna为模板进行pcr扩增，得到扩增产物；分别将各所述扩增产物变性成单链dna；分别对各所述单链dna进行环化处理，得到环化dna；分别向各所述环化dna中加入dna聚合酶和滚环扩增引物组，进行滚环扩增，得到rrna长探针；对各所述rrna长探针进行超声打断，得到rrna探针片段；将各所述rrna探针片段混合，得到rrna探针。通过上述技术方案制备的rrna探针，可用于全转录组测序文库构建，一方面，可有效去除总rna中的rrna，同时可避免去除lncrna、mrna、circrna、sirna等，提高文库产量和建库成功率，获得高质量的测序结果，另一方面，相比于生物素耦联的探针抓取法和探针辅助的rnaseh消化法，本申请提供的rrna探针的制备方法简单，且无需合成生物素等修饰的捕获探针，可有效降低探针合成成本和建库成本，解决了现有技术去除总rna中的rrna成本较高且操作繁杂的技术问题。

技术特征：

1.一种rrna探针的制备方法，其特征在于，所述rrna探针的制备方法包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的rrna探针的制备方法，其特征在于，所述引物组由一条正向引物和一条反向引物组成，其中，正向引物5’端含有磷酸根修饰，每组所述引物组中的正向引物和反向引物的5’端有3-20 bp序列一致。

3.如权利要求1所述的rrna探针的制备方法，其特征在于，所述引物组包括18s引物组和28s引物组，所述18s引物组包括18s引物组1、18s引物组2和18s引物组3，所述28s引物组包括28s引物组1、28s引物组2、28s引物组3和28s引物组4，其中，

4.如权利要求3所述的rrna探针的制备方法，其特征在于，所述rrna探针片段包括18srrna探针片段和28s rrna探针片段，所述将各所述rrna探针片段混合，得到rrna探针的步骤包括：

5.如权利要求3所述的rrna探针的制备方法，其特征在于，所述滚环扩增引物组包括所述18s引物组对应的滚环扩增引物组1以及所述28s引物组对应的滚环扩增引物组2，其中，

6.如权利要求1所述的rrna探针的制备方法，其特征在于，所述分别对各所述单链dna进行环化处理，得到环化dna的步骤包括：

7.如权利要求1所述的rrna探针的制备方法，其特征在于，所述dna聚合酶为phi29dna聚合酶。

8.一种rrna探针，其特征在于，所述rrna探针采用如权利要求1至7任一项所述的rrna探针制备方法制备得到。

9.一种rrna去除方法，其特征在于，应用如权利要求8所述的rrna探针捕获并去除样本rna中的rrna序列。

10.如权利要求9所述的rrna去除方法，其特征在于，所述rrna去除方法包括以下步骤：

技术总结
本申请公开了一种rRNA探针及其制备方法和应用，所述rRNA探针的制备方法包括以下步骤：从人源细胞中提取总RNA，基于总RNA合成cDNA；分别使用预先设计的引物组，以cDNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物；分别将各扩增产物变性成单链DNA；分别对各单链DNA进行环化处理，得到环化DNA；分别向各环化DNA中加入DNA聚合酶和滚环扩增引物组，进行滚环扩增，得到rRNA长探针；对各rRNA长探针进行超声打断，得到rRNA探针片段；将各rRNA探针片段混合，得到rRNA探针。本申请解决了现有技术去除总RNA中的rRNA成本较高且操作繁杂的技术问题。

技术研发人员：张怡然,王冰,郝艳同,周冰,廖蕊,周启明
受保护的技术使用者：南京求臻基因科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13