一种间充质干细胞培养基及其培养方法与应用与流程

本发明属于生物医学领域，尤其涉及一种用于培养和/或扩增间充质干细胞培养基及其培养方法与应用。

背景技术：

1、干细胞作为形成机体各种组织器官的始祖细胞，在特定条件下具有自我复制和多向分化能力，因此干细胞研究具有为大量严重疾患和损伤带来新型治疗方法的无限潜力。某些基于干细胞的治疗，如造血干细胞移植治疗白血病以及上皮干细胞治疗烧伤和角膜疾病，已有成型的临床标准。近年来，干细胞研究的进展已大大拓展了干细胞治疗的应用范围，其中涉及神经系统的疾病包括但不限于：遗传性疾病、神经细胞瘤、帕金森病、脑瘫、肌萎缩性侧索硬化症和脊髓损伤。干细胞移植疗法改变了传统神经修复的观念，已成为治疗难治性疾病的一种新策略。

2、间充质干细胞(mesenchymal stem cells，mscs)是干细胞研究的一个重要分支，最先在骨髓中被发现，因此被统称为骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stemcells，bmscs)，后来相继在脐带等多种结缔组织和器官间质中被发现。

3、间充质干细胞具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在一定诱导条件下具有向成骨细胞、成软骨细胞、成肌细胞、肌腱细胞、脂肪细胞及基质细胞等中胚层细胞分化的能力，同时还可以向外胚层的神经元细胞和内胚层的肝卵圆细胞分化。已有多项研究表明，把mscs植入体内，可向多种造血以外的组织如肺、骨、软骨和皮肤等处定位并分化为相应的组织细胞。

4、此外，间充质干细胞具有免疫调节及免疫重建功能，并且来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，经多次传代扩增后仍具有干细胞特性，不存在免疫排斥。因此，mscs可能成为细胞移植和基因治疗的理想材料。

5、mscs在骨髓移植中有着极其重要的应用价值，一方面在骨髓微环境中支持造血；另一方面，对移植免疫有一定的影响，能够在某些方面减轻移植物抗宿主效应。此外，mscs与其他来源的干细胞相比具有以下优势：(1)获取方便，可从患者本人骨髓等取材；(2)可在体外快速培养扩增，定向诱导分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞；(3)理论上，成体细胞无致瘤风险，安全性高，避免异体骨髓可能带来的传染性疾病、肿瘤和遗传性疾病；(4)具有低免疫源性和免疫调理的特点，避开了免疫排斥的难题；(5)避免了胚胎干细胞带来的伦理问题。因此，mscs及其衍生物成为当今临床移植治疗难治性神经系统疾病主要选择的细胞种类。

6、但是，关于mscs的研究还存在着急需解决的共性问题，主要是：(1)mscs的分离问题，由于人体骨髓中的mscs很少，分离提取得方法极为重要，目前虽在friedenstein方法基础上已在不断改进，但仍不理想；(2)细胞培养问题，培养基与培养方法涉及到反复传代及多向分化性能的保持及bmscs的纯度；(3)定向分化及其功能问题，经诱导因子在体外定向分化为神经元，移植后能否产生突触联系，能否分泌相应的递质，即神经元的功能是临床效果的关键问题；(4)安全问题，如致癌性及载体的安全性。

7、目前广泛应用的人mscs培养体系多采用胎牛血浆，残存的胎牛血浆本身可能引起严重的免疫反应。在体外培养过程中，细胞的吞噬作用使牛血浆中的蛋白分子细胞内在化，即使通过洗涤也不能清除牛血浆蛋白。在正常条件下获得108个mscs大约会携带7～30mg胎牛血浆蛋白，多次输注时存在并发血浆病的危险，严重干扰治疗效果及其评估。因此，建立一种无异种蛋白、高效的人mscs培养体系，是开展相关细胞治疗必需的基础。

8、许多研究者采用无血清，培养方法，但是mscs在无血清条件下增殖缓慢，周期较长，存在分化能力减弱、甚至凋亡的问题，应用细胞因子的费用非常高昂，不能从根本上解决异种蛋白内在化问题。目前已经报道的采用人体血浆或ab血清或如血小板裂解物来解决这一问题的研究。例如，在中国专利申请cn101760445a中公开了一种采用低浓度自体血清培养骨髓间充质干细胞的方法，但是其培养基中还需要添加诸如胰岛素、转铁蛋白、白蛋白等多种细胞生长因子和蛋白成分，导致成本增加且操作繁琐。

技术实现思路

1、本发明的首要目的在于提供一种间充质干细胞培养基，旨在解决上述背景技术中所存在的各种问题。

2、本发明的再一目的在于提供通过上述间充质干细胞培养基培养间充质干细胞的方法。

3、本发明的另一目的在于提供上述间充质干细胞培养基在培养间充质干细胞中的应用。

4、本发明是这样实现的，一种间充质干细胞培养基，该间充质干细胞培养基包括基础细胞培养基，该间充质干细胞培养基还包括添加在基础细胞培养基中的骨髓血浆，骨髓血浆在基础细胞培养基中的体积百分比为2～5％。

5、优选地，所述基础细胞培养基ph为6.8±0.3，渗透压为299±5％。

6、优选地，所述血浆为人骨髓血浆。

7、优选地，所述人骨髓血浆的制备过程为：采集人骨髓15～30ml，加入肝素抗凝，在20～26℃下以1025～1450g离心15～20min，丢弃脂肪层、吸取上清，得到人骨髓血浆。

8、优选地，所述基础细胞培养基中添加110ug/ml的pha。

9、本发明进一步公开了上述的间充质干细胞培养基在培养间充质干细胞中的应用。

10、本发明进一步公开了一种间充质干细胞的培养方法，该方法为将间充质干细胞接种于上述间充质干细胞培养基中，于37℃、100％饱和湿度下，在5％co2培养箱中进行培养。

11、本发明进一步公开了上述培养方法得到的用于再生和/或修复受损的肺、骨、软骨、皮肤、肝脏、肾脏的组合物的间充质干细胞bmscs。

12、本发明克服现有技术的不足，提供一种用于培养和/或扩增间充质干细胞培养基及其培养方法。本发明的发明点在于：

13、(1)基础细胞培养基中添加pha，培养效果更好；

14、(2)采用体积分数为2～5％的人自体骨髓血浆添加到基础细胞培养基中以半骨髓法培养骨髓间充质干细胞，其培养方法操作方便、损伤小，完全用以前分离培养方法中废弃的自体骨髓血浆作为营养基质，且骨髓血浆来自自体，无免疫排斥和疾病传染的潜在风险；由于不用淋巴细胞分离液分离细胞，尽量减少外源性成分的接触，并保留了部分ficoll密度梯度离心法结合贴壁法分离掉营养物质，同时应用特制培养基，配合补充骨髓血浆中的成分，又保留bmscs原来的生长环境。

15、本发明选择当今常用的分离培养的方法作为对照，观察新方法的分离培养的效果，发现用2种不同的体外培养体系，获得的bmscs均具有bmscs的一般生物学特性：细胞为典型的成纤维细胞样，呈漩涡状贴壁生长，有黏附特性；体外扩增至5代，细胞形态不发生明显改变，培养的细胞稳定表达cd90、cd44，且结果相似。所得细胞是骨髓中一群处于未分化状态的非定向干细胞，而且不是造血干细胞、内皮祖细胞，也非纤维细胞，细胞表型一致率极高，符合目前公认的bmscs特征。以骨髓血浆作为营养基质半骨髓法分离培养bmscs的新方法，培养传代时间明显短于常规胎牛血清培养组：从原代到p5代培养时间分别为25天(骨髓血浆)、29天(胎牛血清)。而本发明新方法原代、p1代、p3代活细胞计数分别为(4.94×105、6.73×105、6.99×105)高于胎牛血清组(分别为4.19×105、5.37×105、6.73×105)。以骨髓血浆作为营养基质半骨髓法分离培养bmscs的新方法的培养优势在于：骨髓血浆与自体bmscs同源，保持原bmscs的部分环境和营养成分，半骨髓法减少了淋巴细胞分离液离心分离造成的细胞数量和部分营养成分的丢失，因此其培养的各代细胞数较高、活率高、死亡率低，利用该方法传代培养5代所获得的细胞数量基本可以满足临床治疗和相关研究需要，具有极大的临床应用价值。

16、在本发明研究中还观察了以骨髓血浆作为营养基质半骨髓法分离培养的bmscs多向分化的能力(成骨样和成肝样细胞分化)，之所以选择成骨样和成肝样细胞分化进行研究，除了证明生成的bmscs有多向分化的能力外，另一方面是因为通常成骨和成肝细胞分化后移植用于临床治疗所需的细胞数量(通常成骨细胞局部移植细胞量和肝动脉移植细胞量均超过1×1010个)远远超过bmscs成神经分化后移植用于临床所需的细胞数(通常蛛网膜下腔移植1次大约为2～4×107个)，对培养基的是否含外源性蛋白要求更高。本发明使用的新方法获得的bmscs，在一定外源条件下可以向成骨样和肝样细胞方向分化，更适合于临床的需要。本发明优选的实施方案是完成自体bmscs的自体体液培养、传代，移植干细胞从分离、培养到诱导的整个体外过程，未接触任何含异体和异种动物源的成分，解决了培养基中含有异种和异体蛋白的问题，从而避免了培养后细胞移植发生血浆病、异种蛋白过敏和免疫排斥现象，更符合临床干细胞移植的需要。这种采用自体血浆和离心方法的半全髓法培养bmscs，既能减少病人痛苦(另抽血清)，又能实现无人畜共患疾病，还能避免异种蛋白的反应(胎牛血清)，减少不必要的开支(刺激因子)。