一种预测抗PD-1免疫治疗的肺癌预后标记物及其应用

本发明属于生物医学，具体涉及一种预测抗pd-1免疫治疗的肺癌预后标记物及其应用，尤其涉及一种tmprss2在预测抗pd-1免疫治疗的肺癌预后标记物中的应用。

背景技术：

1、肺癌作为一种世界性的恶性肿瘤，主要类型是小细胞肺癌(sclc)和非小细胞肺癌(nsclc)。其中，nsclc主要细分为腺癌(luad)和鳞状细胞癌(lusc)(he j,gao r,meng m,yum,liu c,li j,song y,wang h:lysophosphatidic acid receptor 6(lpar6)is apotential biomarker associated with lung adenocarcinoma.int j environ respublic health 2021,18(21).li m,pei j,xu m,shu t,qin c,hu m,zhang y,jiang m,zhu c:changing incidence and projections of thyroid cancer in mainland china,1983-2032:evidence from cancer incidence in five continents.cancer causescontrol 2021,32(10):1095-1105.)。目前，与以往的化疗和手术治疗相比，越来越多的靶向治疗和免疫检查点抑制剂治疗被应用于癌症的治疗，并已成为治疗癌症的关键(tan ac,tan dsw:targeted therapies for lung cancer patients with oncogenic drivermolecular alterations.jclin oncol 2022,40(6):611-625.)。其中，pd-1轴的抑制，包括抗体介导的程序性细胞死亡蛋白1(pd-1)和程序性细胞凋亡配体1(pd-l1)阻断，广泛应用于实体和血液系统恶性肿瘤的治疗。由于pd-l1作为pd-1的配体，在人nsclc中表达，抗pd-1/pd-l1免疫检查点抑制剂被用于治疗晚期nsclc(hsu pc,jablons dm,yang ct,youl.epidermal growth factor receptor(egfr)pathway,yes-associated protein(yap)and the regulation of programmed death-ligand 1(pd-l1)in non-small cell lungcancer(nsclc).int j mol sci.2019aug 5；20(15):3821)，提高了许多nsclc患者的生存率(tan ac,tan dsw:targeted therapies for lung cancer patients with oncogenicdriver molecular alterations.j clin oncol 2022,40(6):611-625.larsen tv,hussmann d,nielsenal:pd-l1 and pd-l2 expression correlated genes in non-small-cell lung cancer.cancer commun(lond)2019,39(1):30.he j,meng m,wang h:anovel prognostic biomarker lpar6 in hepatocellular carcinoma via associatingwith immune infiltrates.j clin transl hepatol 2022,10(1):90-103.)。目前用于治疗nsclc的抗pd-1免疫检查点抑制剂主要有纳武利尤单抗、西米普利单抗，然而，免疫药物仅使一小部分患者受益，不良预后仍然是高死亡率的主要原因。因此，确实有必要找到影响癌症预后的因素或调节剂，以辅助现有的治疗方法改善患者的预后，提高患者的生存率。

2、tmprss2编码丝氨酸蛋白酶，其包含受体a型结构域、ii型跨膜结构域、富含半胱氨酸的清道夫受体结构域和蛋白酶结构域。参与广泛的生物过程(glowacka i,bertram s,müller ma,allen p,soilleux e,pfefferle s,steffen i,tsegaye ts,he y,gnirss k etal:evidence that tmprss2 activates the severe acute respiratory syndromecoronavirus spike protein for membrane fusion and reduces viral control bythe humoral immune response.jvirol 2011,85(9):4122-4134.)。研究发现，tmprss2在新冠感染中起着重要作用。它有助于启动冠状病毒的刺突(s)蛋白，并与血管紧张素转换酶2(ace2)一起帮助病毒进入目标细胞感染宿主(he j,lin y,meng m,li j,yang jy,wangh:construction of a human cell landscape of covid-19infection at single-celllevel.aging dis 2021,12(3):705-709.hoffmann m,kleine-weber h,schroeder s,krüger n,herrler t,erichsen s,schiergens ts,herrler g,wu nh,nitsche a et al:sars-cov-2cell entry depends on ace2 and tmprss2 and is blocked by aclinically proven protease inhibitor.cell 2020,181(2):271-280.e278.)。

3、同时，据报道，tmprss2是癌症发展的一个重要因素(hossain d,bostwick dg:significance of the tmprss2:erg gene fusion in prostate cancer.bju int 2013,111(5):834-835.)。tmprss2在前列腺癌细胞中被雄性激素上调，而在不依赖雄性激素的前列腺癌组织中则被下调。tmprss2的沉默可以抑制前列腺癌细胞的增殖(hossain d,bostwick dg:significance of the tmprss2:erg gene fusion in prostatecancer.bju int2013,111(5):834-835.)。在乳腺癌研究中，体外tmprss2及其下游信号通路的调节可以促进肿瘤细胞的迁移和转移(chi m,shi x,huo x,wu x,zhang p,wang g:dexmedetomidine promotes breast cancer cell migration through rab11-mediatedsecretion of exosomal tmprss2.ann transl med 2020,8(8):531.)。此外，研究表明，癌症患者感染sars-cov-2的风险更大(wang q,li l,qu t,li j,wu l,li k,wang z,zhu m,huang b,wu w et al:high expression of ace2 and tmprss2 at the resectionmargin makes lung cancer survivors susceptible to sars-cov-2with unfavorableprognosis.front oncol 2021,11:644575.)，所有这些发现表明tmprss2编码的蛋白质可能在癌症中发挥重要作用，但tmprss2与肺癌进展之间的关联及其潜在机制未有相关报道。因此，为预后监测目的研究和开发在肺癌中异常表达的基因和/或蛋白具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种预测抗pd-1免疫治疗的肺癌预后标记物及其应用。

2、本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

3、本发明提供了一种预测抗pd-1免疫治疗的肺癌预后标记物，所述肺癌预后标记物包括tmprss2。

4、抗pd-1治疗作为最新疗法，对抗pd-1治疗有响应的非小患者现阶段还是小部分人群，由于肿瘤微环境的不同及耐药机制的产生，现有的标记物(如tmb、msi)在对抗pd-1治疗的非小患者的预后预测效果不佳，发明人发现，tmprss2在免疫治疗---抗pd-1治疗的人群中的预后指导意义，即在抗pd-1治疗无响应的非小患者中，该基因(蛋白)量越高，预后越好。对抗pd-1治疗无响应的非小患者施加tmprss2激动剂，将有助于提升该类患者的生存期。

5、进一步，所述tmprss2是人的tmprss2，所述tmprss2的ncbi登录号为7113。

6、进一步，所述的肺癌为非小细胞肺癌；所述的非小细胞肺癌为肺腺癌或肺鳞癌。

7、进一步，所述肺癌预后标记物还包括il2rb。

8、进一步，本发明还提供了一种鉴定试剂在制备预测肺腺癌预后的产品中的用途，其中：所述的鉴定试剂特异性地确定tmprss2基因或其表达产物在受试者样本中的存在和/或水平。所述tmprss2的基因表达产物包括tmprss2的mrna或其互补序列、tmprss2的cdna或其互补序列、tmprss2的成熟蛋白、tmprss2的前体蛋白中的一种或几种；或上述任一形式的片段、突变体、衍生物或修饰产物。

9、本发明还提供了一种所述的肺癌预后标记物在制备肺癌的早期诊断、风险评估、联合免疫治疗或预后程度预测的试剂盒、检测试剂、芯片、试纸、孔板、胶乳颗粒或磁珠中的用途。

10、进一步，所述试剂盒包括tmprss2的mrna或蛋白水平的分子。

11、本发明还提供一种肺癌的早期诊断、风险评估、联合免疫治疗或预后程度预测的试剂盒。所述试剂盒中含有能特异性检测tmprss2的基因表达产物。

12、进一步，所述tmprss2的基因表达产物包括tmprss2的mrna或其互补序列、tmprss2的cdna或其互补序列、tmprss2的成熟蛋白、tmprss2的前体蛋白中的一种或几种；或上述任一形式的片段、突变体、衍生物或修饰产物。

13、进一步，所述试剂盒中含有能特异性结合tmprss2基因编码蛋白的抗体或其片段。

14、本发明还提供一种tmprss2基因抑制剂在制备治疗肺癌药物中的用途，所述的tmprss2基因抑制剂以tmprss2基因为作用靶标制备或筛选得到的对tmprss2具有抑制效果的分子或制剂。

15、在一些实施方式中，所述的受试者是哺乳动物，例如但不限于：人、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、牛、羊、马、骆驼、猪、犬、猫、猴或猿。在一些具体的实施方式中，所述的哺乳动物是人。在一些实施方式中，所述的水平是蛋白质水平，尤其是针对肺腺癌或肺鳞癌；在这些实施方案中，鉴定试剂可基于本领域已知的定量或定性免疫测定方案鉴定蛋白质水平，免疫测定形式可以包括，但不限于，酶联免疫吸附测定(elisa)、放射性免疫测定(ria)、夹心测定、蛋白质印迹、免疫沉淀、免疫组织化学染色、流式细胞术、荧光辅助的细胞分选(facs)、酶底物显色测定和抗原-抗体聚集。

16、鉴定试剂包括特异性结合tmprss2基因编码蛋白的抗体或其片段。可以使用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或其片段，只要它结合靶蛋白质即可。本发明的产品中包括的抗体或其片段可以是单克隆的或多克隆的。抗体片段指保留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肽。抗体片段可以包括f(ab′)2、fab′、fab、单链fv(scfv)、二硫化物键合的fv(dsfv)或其聚合物、二聚化v区(双抗体)、或含有cdr的肽。本发明的鉴定试剂可以包括编码抗体或编码抗体片段的氨基酸序列的分离的核酸，包含该核酸的载体，和携带该载体的细胞。在另一些实施方式中，所述的水平是核酸水平，尤其是针对肺腺癌；在这些实施方案中，鉴定试剂可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能：如pcr、如southern杂交、northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(fish)、dna微阵列、aso法、高通量测序平台等。使用本发明的产品可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。

17、在一些实施方式中，所述的样本选自为肿瘤组织，例如，通过组织活检、冷冻保存样本、冰冻切片样本、福尔马林保存组织等方式获得或保存的肿瘤组织。

18、在一些实施方式中，本发明的产品可以是试剂、试剂盒、芯片、试纸、孔板、胶乳颗粒、磁珠等。

19、在一些实施方案中，预后是指选自以下的一种或组合：预后受试者的结局、预后受试者的治疗效果、预后受试者的生存。

20、在一些具体的实施方案中，“预后”是指癌症患者在通过手术处理等抑制或缓解肿瘤生长后的过程或结果。在本说明书中，预后可以是通过手术处理抑制或缓解肿瘤生长后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20年或更久时的生机状态。预后可以通过检测tmprss2来预测。

21、预后预测可以这样进行：基于tmprss2基因或其表达产物的在肺腺癌患者样本中的水平与肺腺癌患者预后正相关，在肺鳞癌患者样本中的水平并未表现出与肺鳞癌患者的预后具有相关性。确定肺腺癌患者的预后是良好还是不良，或者确定良好预后或不良预后的概率。例如，在此实施方式中，可以使用四分位数分析，在进行基因分组的时候，使用表达的前25％作为高表达组，后25％作为低表达组。在本发明中，“预后良好”是指在通过手术处理等为患者抑制或缓解肿瘤生长之后，患者长时期(例如3、5、6、7、8、9、10、15、20年或更长)没有危急状况。或者，预后好可以意指在这样长时间内存活、无转移、无复发、或无再发。例如，预后良好可以意指至少3年或是至少5年存活，优选没有转移或复发。预后良好最优选的状态是长期无疾病的存活。如本文中所使用的，“预后良好”还可以包括任何这样的状态，其中可以发现疾病如转移，但是恶性低且不严重地影响生存能力。

22、在本发明中，“预后不良”是指患者在通过手术处理等抑制或缓解肿瘤生长后的短时期(例如1、2、3、4、5年或更短)内发生致命状况。或者，预后差是指在这样的短时期里死亡、转移、复发、或再发。例如，预后差可以意指至少3年或至少5年内复发、转移、或死亡。

23、预测预后是指预测患者状况的过程或结果，并不意味着能以100％的准确度预测患者状况的过程或结果。预测预后是指确定某些过程或结果的可能性是否增加，而并不意味着通过与某些过程或结果不发生的情况比较来确定发生某些过程或结果的可能性。

24、进一步，所述肺癌预后标记物还包括il2rb，即tmprss2加上il2rb联合单独作为生物标志物。在上述肺癌预后标记物的应用中，与tmprss2相同。

25、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

26、由于现有技术缺乏足够的生物标志物以便对肺腺癌患者的预后做出预测，尤其是对于肺腺癌晚期的患者。此外，由于越来越多的靶向治疗和免疫检查点抑制剂治疗被应用于癌症的治疗，但是免疫药物只对一小部分患者有益，预后不良仍然是高死亡率的主要原因。因此，找到影响癌症预后的因素或调节剂，以辅助现有的治疗方法改善患者的预后至关重要。本发明提供了一种tmprss2作为预测抗pd-1免疫治疗的肺腺癌预后标志物并建立了预测肺腺癌患者预后的模型。最后，通过k-m plot曲线，roc曲线及患者的生存时间和生存状态验证了模型的准确性和特异性。