使用表达雪胆三萜合成酶HcOSC6基因的工程菌制备雪胆素的方法

本发明属于基因工程，具体的说，涉及一种使用表达雪胆三萜合成酶hcosc6基因的工程菌制备雪胆素的方法。

背景技术：

1、雪胆(hemsleya chinensis)是葫芦科、雪胆属植物。多年生攀援草本。块茎膨大，扁卵圆形，常半裸露于土面。块茎入药。雪胆素有解热毒，健脾胃，止疼痛。主治肺热咳嗽、胃溃疡、胃痛、肠炎、泌尿系统感染及其他多种感染。块茎主要药用成分是雪胆素(雪胆甲素和雪胆乙素)，味苦，因其植物中含量低且提取效率低，因此从定点突变改变雪胆素酶基因表达，提高雪胆素含量至关重要。

2、为了供应市场和提高雪胆素的产量，本发明公开了一种使用表达雪胆三萜合成酶hcosc6基因的工程菌制备雪胆素的方法。

技术实现思路

1、为了克服背景技术中存在的问题，本发明提供了一种使用表达雪胆三萜合成酶hcosc6基因的工程菌制备雪胆素的方法。

2、为实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：

3、使用表达雪胆三萜合成酶hcosc6基因的工程菌制备雪胆素的方法，其特征在于：包含以下步骤：

4、s1，查找ncbi序列，基于大肠杆菌中密码子偏好性进行优化并截短，从雪胆的组织中克隆出hcosc6并设计适于大肠杆菌表达的基因，装载到pyes2质粒载体上，得到pyes2-hcosc6重组质粒；

5、s2，设计突变引物对，突变引物对为：l250a、y336a和i551a中的一个，三对引物的序列依次如seq id.1～2、seq id.3～4、seq id.5～6所示；

6、s3，以pyes2-hcosc6重组质粒为模板进行pcr扩增，得到突变的pyes2-hcosc6重组质粒，然后经过dpni酶切反应后，将突变质粒pyes2-l250a、pyes2-y336a、pyes2-i551a转化大肠杆菌e--.coli dh5α感受态细胞，经过amp抗性筛选阳性克隆；

7、s4，突变成功的菌体平板划线，挑菌，摇菌，重提质粒，转化到gil77酿酒酵母感受态细胞，构建工程菌gil77/pyes2-hcosc6。

8、进一步的，所述的s3步骤中，pcr反应的反应条件为98℃预变性3min；98℃变性10s，58℃退火复性30s，72℃延伸3min30s，循环35次；72℃充分延伸3min30s。

9、进一步的，所述的s3步骤中，pcr反应的反应体系为：

10、

11、进一步地，所述的s4步骤中重提质粒时的消化反应体系为：

12、

13、本发明的有益效果：使用本发明可快速的表达出雪胆素，为雪胆素的生产和提高产量提供了一种新的思路。

技术特征：

1.使用表达雪胆三萜合成酶hcosc6基因的工程菌制备雪胆素的方法，其特征在于：包含以下步骤：

2.根据权利要求1所述的使用表达雪胆三萜合成酶hcosc6基因的工程菌制备雪胆素的方法，其特征在于：所述的s3步骤中，pcr反应的反应条件为98℃预变性3min；98℃变性10s，58℃退火复性30s，72℃延伸3min30s，循环35次；72℃充分延伸3min30s。

3.根据权利要求1所述的使用表达雪胆三萜合成酶hcosc6基因的工程菌制备雪胆素的方法，其特征在于：所述的s3步骤中，pcr反应的反应体系为：

4.根据权利要求1所述的使用表达雪胆三萜合成酶hcosc6基因的工程菌制备雪胆素的方法，其特征在于：所述的s4步骤中重提质粒时的消化反应体系为：

技术总结
本发明涉及一种使用表达雪胆三萜合成酶HcOSC6基因的工程菌制备雪胆素的方法，属于基因工程技术领域，本发明以pYES2‑HcOSC6重组质粒为模板，使用三对引物：SEQ ID.1～2、SEQ ID.3～4、SEQ ID.5～6，进行PCR扩增，得到突变的pYES2‑HcOSC6重组质粒，然后经过DpnI酶切反应后，将突变质粒pYES2‑L250A、pYES2‑Y336A、pYES2‑I551A转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，经过Amp抗性筛选阳性克隆；突变成功的菌体平板划线，挑菌，摇菌，重提质粒，转化到GIL77酿酒酵母感受态细胞，构建工程菌GIL77/pYES2‑HcOSC6。本发明可快速的表达出雪胆素，为雪胆素的生产和提高产量提供了一种新的思路。

技术研发人员：赵艳,李霞,翟晨曦,高青青,向春繁,袁成晓,梁艳丽,杨生超,张广辉
受保护的技术使用者：云南农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13