一种培养DF-1细胞的完全培养基的制作方法

本发明涉及细胞培养，尤其是涉及一种培养df-1细胞的完全培养基。

背景技术：

1、df-1细胞是一种可传代的鸡成纤维细胞系。df-1来源于ell鸡胚胎，该细胞无禽白血病病毒、肉瘤病毒内源性基因，同时在形态上呈纤维状。df-1细胞系是一种稳定的、无肿瘤基因、自发无限增值的细胞系。被广泛用于动物病毒研究、疫苗研制、癌症研究等诸多领域。是生命科学领域重要的病毒转染、培养生物材料。

2、df-1细胞的常规培养体系中均需要加入10％～15％的动物血清，常用胎牛血清。血清是由很多大小不同的生物分子组成的复杂混合物，虽然其大部分组成成份已为人所知，但还有一部分尚不清楚。

3、血清在细胞培养中的作用主要有以下几方面：(1)提供细胞生存和增殖(3)含有一些可供贴壁型细胞贴壁生长的基质成分；(4)提供载体蛋白，可结合维生素、脂质、金属离子等；(5)在一些情况下，中和毒性物质保护细胞不受伤害；(6)给培养液提供良好的缓冲系统；(7)提供蛋白酶抑制剂，保护细胞免受死细胞释放的蛋白酶的伤害。

4、但是，添加血清的培养基在细胞培养中也存在诸多缺陷，例如：(1)血清也含一些对细胞产生毒性的物质，如多胺氧化酶，能与来自高度繁殖细胞的多胺(如精胺、亚精胺)反应形成有细胞毒性作用的(2)血清可能促进某些细胞的生长同时抑制另一类细胞生长；(3)可能存在动物携带的已知未知的病原体，对以后的临床应用构成威胁，且每个批次的血清之间存在批间差异，使得细胞培养结果出现差异；(4)血清来源越来越困难，价格昂贵，是构成动物细胞培养生产成本的主要部分之一。

5、基于上述原因，科研工作者在积极开发不含动物血清的df-1细胞培养基。但是不含动物血清的df-1细胞培养基普遍存在组成成分种类繁多、配制所需时间长的问题，例如专利cn112210542a中的培养基需要55种不同浓度的组分。此外，无血清培养基还普遍存在df-1细胞生长缓慢、甚至出现停滞增殖等问题。这将直接影响df-1细胞的稳定传代、细胞实验的结果准确性与可靠性以及细胞相关产品的生产效率。

6、因此，有必要研究出一种含血清浓度低的完全培养基，以克服目前df-1细胞培养基存在的组分繁多、重复性差、培养效果不理想、成本高的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种培养df-1细胞的完全培养基，以解决目前df-1细胞的常规培养基中添加动物血清量大，使培养的细胞及细胞产品含细菌毒素、携带病原体的风险高；血清价格昂贵，导致生产成本高；血清批间存在差异，导致培养效果不稳定；以及无血清培养基组分繁多、df-1细胞生长较缓慢、会出现增殖停滞的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供一种培养df-1细胞的完全培养基，包括dmem基础培养基13.7g/l，胰岛素，非必需氨基酸，转铁蛋白，谷胱甘肽，抗坏血酸磷酸盐，亚硒酸钠，乙醇胺，氢化可的松，新生牛血清。

3、优选的，所述非必需氨基酸包括甘氨酸，丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，天冬酰胺。

4、优选的，包括胰岛素1～15mg/l，甘氨酸20～45mg/l，丙氨酸5～25mg/l，脯氨酸2～20mg/l，丝氨酸40～60mg/l，天冬酰胺5～25mg/l，转铁蛋白1～20mg/l，谷胱甘肽0.1～10mg/l，抗坏血酸磷酸盐0.1～6mg/l，亚硒酸钠0.1～8ug/l，乙醇胺0.1～6mg/l，氢化可的松0.01～6mg/l，新生牛血清10～60ml/l。

5、优选的，包括胰岛素15mg/l，甘氨酸45mg/l，丙氨酸25mg/l，脯氨酸20mg/l，丝氨酸60mg/l，天冬酰胺25mg/l，转铁蛋白20mg/l，谷胱甘肽10mg/l，抗坏血酸磷酸盐6mg/l，亚硒酸钠8ug/l，乙醇胺6mg/l，氢化可的松6mg/l，新生牛血清60ml/l。

6、优选的，包括胰岛素1mg/l，甘氨酸20mg/l，丙氨酸5mg/l，脯氨酸2mg/l，丝氨酸40mg/l，天冬酰胺5mg/l，转铁蛋白1mg/l，谷胱甘肽0.1mg/l，抗坏血酸磷酸盐0.1mg/l，亚硒酸钠0.1ug/l，乙醇胺0.1mg/l，氢化可的松0.01mg/l，新生牛血清10ml/l。

7、优选的，包括胰岛素7mg/l，甘氨酸34mg/l，丙氨酸10mg/l，脯氨酸9mg/l，丝氨酸50mg/l，天冬酰胺15mg/l，转铁蛋白6mg/l，谷胱甘肽2mg/l，抗坏血酸磷酸盐2mg/l，亚硒酸钠3ug/l，乙醇胺2mg/l，氢化可的松0.03mg/l，新生牛血清20ml/l。

8、优选的，将各个组分加水搅拌溶解后，溶液用0.22um的滤膜过滤除菌。

9、一种如上所述的df-1细胞完全培养基在培养df-1细胞中的应用。

10、因此，本发明提供的一种培养df-1细胞的完全培养基，其具体技术效果如下：

11、(1)本发明的完全培养基采用低浓度的新生牛血清及其他添加成分进行复配，能很好地促进df-1细胞增殖，在促进细胞增殖方面可以达到与高浓度胎牛血清相同的效果，适用于df-1细胞的贴壁培养；

12、(2)本发明的完全培养基采用低浓度的新生牛血清，可以大大避免添加高浓度血清的培养基带来的批次间差异、培养结果不稳定、细胞毒性以及携带病原体风险高，应用范围窄、胎牛血清价格昂贵，培养成本高等问题；

13、(3)本发明的完全培养基组成成分简单，培养基配制过程耗时短，培养效率高，重复性好，具有工业化和商业化的前景，适于批量生产。

14、下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

技术特征：

1.一种培养df-1细胞的完全培养基，其特征在于：包括dmem基础培养基13.7g/l，胰岛素，非必需氨基酸，转铁蛋白，谷胱甘肽，抗坏血酸磷酸盐，亚硒酸钠，乙醇胺，氢化可的松，新生牛血清。

2.根据权利要求1所述的一种培养df-1细胞的完全培养基，其特征在于：所述非必需氨基酸包括甘氨酸，丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，天冬酰胺。

3.根据权利要求1所述的一种培养df-1细胞的完全培养基，其特征在于：包括胰岛素1～15mg/l，甘氨酸20～45mg/l，丙氨酸5～25mg/l，脯氨酸2～20mg/l，丝氨酸40～60mg/l，天冬酰胺5～25mg/l，转铁蛋白1～20mg/l，谷胱甘肽0.1～10mg/l，抗坏血酸磷酸盐0.1～6mg/l，亚硒酸钠0.1～8ug/l，乙醇胺0.1～6mg/l，氢化可的松0.01～6mg/l，新生牛血清10～60ml/l。

4.根据权利要求1所述的一种培养df-1细胞的完全培养基，其特征在于：包括胰岛素15mg/l，甘氨酸45mg/l，丙氨酸25mg/l，脯氨酸20mg/l，丝氨酸60mg/l，天冬酰胺25mg/l，转铁蛋白20mg/l，谷胱甘肽10mg/l，抗坏血酸磷酸盐6mg/l，亚硒酸钠8ug/l，乙醇胺6mg/l，氢化可的松6mg/l，新生牛血清60ml/l。

5.根据权利要求1所述的一种培养df-1细胞的完全培养基，其特征在于：包括胰岛素1mg/l，甘氨酸20mg/l，丙氨酸5mg/l，脯氨酸2mg/l，丝氨酸40mg/l，天冬酰胺5mg/l，转铁蛋白1mg/l，谷胱甘肽0.1mg/l，抗坏血酸磷酸盐0.1mg/l，亚硒酸钠0.1ug/l，乙醇胺0.1mg/l，氢化可的松0.01mg/l，新生牛血清10ml/l。

6.根据权利要求1所述的一种培养df-1细胞的完全培养基，其特征在于：包括胰岛素7mg/l，甘氨酸34mg/l，丙氨酸10mg/l，脯氨酸9mg/l，丝氨酸50mg/l，天冬酰胺15mg/l，转铁蛋白6mg/l，谷胱甘肽2mg/l，抗坏血酸磷酸盐2mg/l，亚硒酸钠3ug/l，乙醇胺2mg/l，氢化可的松0.03mg/l，新生牛血清20ml/l。

7.根据权利要求1所述的一种培养df-1细胞的完全培养基，其特征在于：将各个组分加水搅拌溶解后，溶液用0.22um的滤膜过滤除菌。

8.一种如权利要求1-7任一项所述的df-1细胞完全培养基在培养df-1细胞中的应用。

技术总结
本发明公开了一种培养DF‑1细胞的完全培养基，包括DMEM基础培养基13.7g/L，胰岛素，非必需氨基酸，转铁蛋白，谷胱甘肽，抗坏血酸磷酸盐，亚硒酸钠，乙醇胺，氢化可的松，新生牛血清。其中非必需氨基酸包括甘氨酸，丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，天冬酰胺。本发明提供的一种培养DF‑1细胞的完全培养基，能很好地促进DF‑1细胞增殖，可以达到与高浓度胎牛血清相同的增殖效果，适于DF‑1细胞的贴壁培养；采用低浓度的新生牛血清，可以大大避免添加高浓度血清的培养基带来的批次间差异、培养结果不稳定、细胞毒性以及携带病原体风险高，应用范围窄、胎牛血清价格昂贵，培养成本高等问题；组成成分简单，培养基配制过程耗时短，培养效率高，重复性好，适于批量生产。

技术研发人员：白花,赵峻岭,黄新朋
受保护的技术使用者：内蒙古奥普赛生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12