构建嵌合蛋白的嵌合区域、构建方法、嵌合蛋白及其应用与流程

本发明涉及生物医药领域。具体而言，本发明涉及一种用于构建嵌合蛋白的嵌合区域、构建方法、嵌合蛋白、制备方法以及应用，本发明还涉及该嵌合蛋白的衍生物、缀合物、药物组合、核酸分子、表达载体和宿主细胞。

背景技术：

1、细胞因子(cytokine，ck)是细胞产生的低分子量可溶性蛋白质，按照其功能可分为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子、生长因子等。细胞因子通过结合细胞表面相应的细胞因子受体，介导细胞内信号转导而发挥多种生物学功能，包括免疫调节、血细胞生成、细胞生长以及损伤组织修复等。因此基于细胞因子的药物是药物开发中的重要领域。然而许多天然的细胞因子并不适合作为药物。因为一种细胞因子通常可结合多种表达在不同细胞表面的多种受体，传递着不同的信号，另外同一种受体也可以结合不同的细胞因子，这导致细胞因子的作用具有多效性、重叠性、拮抗性、协同性等多种生理特性。临床治疗中需要特定激活细胞因子参与的一个特异信号，而不激活不必要的信号，进一步执行预期功能，而达到治疗效果好而毒副作用小的目的。细胞因子受体绝大多数是跨膜蛋白，由胞外域、跨膜区和胞浆区组成。

2、例如，以白细胞介素2为例，白细胞介素2(interleukin-2，il-2)也称作t细胞生长因子(tcgf)，是一种15.5kda球状糖蛋白，它具有133个氨基酸的长度。il-2的结构由四个反平行的、两亲性的α螺旋和一些链接序列(loop)组成(smith，science240，1169-76(1988)；bazan，science257，410-413(1992))。il-2主要来源于活化的cd4+t细胞、活化的cd8+t细胞、自然杀伤(nk)细胞、树突状细胞和巨噬细胞，可通过与细胞表面的il-2受体结合来调节其作用。

3、il-2受体是由三个亚基组成的复合体，三个亚基分别为il-2rα(即cd25)、il-2rβ(即cd122)和il-2rγ(即cd132)。这三个亚基的表达以及他们与il-2的亲和力各不相同。其中il-2rβ亚基和il-2rγ亚基形成的异源二聚il-2受体主要由细胞毒性cd8+t细胞和nk细胞表达，与il-2中等亲和力结合，称为中等亲和力il-2受体(il-2rβγ)。由il-2rα亚基、il-2rβ亚基和il-2rγ亚基形成的异源三聚il-2受体主要表达在调节性t细胞(treg)(byman，0.和sprent.j.nat.rev.immunol.12，180-190(2012))，并与il-2高亲和性结合(亲和力比二聚体受体高约100倍)，称为高亲和力il-2受体(il-2rαβγ)。另外发现一些内皮细胞表面也有il-2的受体α(cd25)亚基的表达。il-2rβ和il-2rγ是il-2激活下游信号通路所必需的，当il-2同时结合il-2rβ和il-2rγ时，两个受体亚基形成异源二聚体，磷酸化细胞内的stat5，进入细胞核导致相应的基因转录和表达；il-2rα并非信号所必需，但可以促进il-2与il-2rβ和il-2rγ的结合。il-2rγ在所有免疫细胞中均有表达；il-2rβ在cd8+t细胞、nk细胞、调节性t细胞中均有表达，而且在t细胞被激活后还会提升表达水平；il-2rα在调节性t细胞持续高表达，在被激活的cd8+t细胞中会有短暂表达，随即下调表达水平。由于静息状态的效应t细胞和nk细胞在细胞表面上没有il-2rα，故对于il-2相对不敏感。而treg细胞在体内一贯表达最高水平的il-2rα，因此，正常情况下il-2会优先剌激treg细胞增殖。

4、il-2在体内具有扩充淋巴细胞群体和提高这些细胞的效应器的功能，尤其是对cd8+t细胞和nk细胞的增殖和活化赋予了il-2的抗肿瘤能力。il-2是历史上第一个用于肿瘤免疫治疗的细胞因子，抗肿瘤作用已得到临床证实。高剂量il-2治疗已经批准用于具有转移性肾细胞癌和恶性黑素瘤的患者。经过多年的临床应用，人们对于il-2的认识更加深入，il-2的临床应用也带来了诸多问题。

5、首先与il-2免疫疗法有关的一项担忧是由重组人il-2治疗产生的副作用。接受高剂量il-2治疗的患者发生血管(或毛细血管)渗漏综合征(vls)，血管通透性的一种病理性升高，导致多个器官中的流体外渗(引起例如肺和皮肤水肿和肝细胞损伤)和血管内流体消减(引起血压下降和心率补偿性升高)。除了il-2停药以外，vls没有治疗。研究发现，发生vls可能与il-2与内皮细胞表达的il-2ra结合有关(kriegetal.，procnatacadsciusa107，11906-11(2010))。其次，由于il-2与高表达在抑制性调节t细胞(treg)的高亲和力il-2受体结合，而维持外周treg细胞的数量和活性(maloyandpowrie，natureimmunol6，1171-72(2005))。treg细胞遏制效应t细胞破坏它们的靶物；或是经由细胞-细胞接触抑制t细胞辅助和激活；或是经由释放免疫遏制性细胞因子，诸如il-10或tgf-β，消减il-2诱导的抗肿瘤免疫力(imaietal.，cancersci98，416-23(2007))。另外，由于il-2的分子量较小，其在体内的半衰期短，需要持续给药才能维持体内高浓度的il-2。

6、抑制il-2与高亲和力il2受体(il-2rαβγ)的结合，保留或增强与中等亲和力il2受体(il-2rβγ)的结合，并延长其半衰期是克服il-2在肿瘤免疫治疗中问题的关键。现在已经有多种方法被开发来克服这些与il-2免疫疗法有关的问题。例如，通过il-2突变体来改变il-2对不同受体的亲和特异性。如merck公司的突变体(r38w，f42k，wo2008003473a2)，降低与α受体亚基的相互作用，以其达到效应t细胞活化以增强功效；而roche的il-2突变体(f42a，y45a和l72g，us2016/0208017a1)，其与α受体不结合，但可以正常结合β和γ受体亚基复合物，并可以发挥效应，目前正在临床中。还有一些方法通过开发il-2的抗体封闭il-2与il-2rα的结合，而保留与il-2rβγ的结合。但目前这些开发大部分都处于研究阶段，临床上仍需要具有偏向性激活il-2rβγ的il-2或衍生物用于肿瘤免疫治疗。

7、因此，开发出能够偏向性激活中等亲和力il2受体(il-2rβγ)的长效型细胞因子或蛋白，进而更好地作为临床药物，特别是用于肿瘤免疫治疗，十分必要。

8、再比如il-15是il-2家族的另一具有抗肿瘤活性的成员，其受体由三个受体亚基组成：il-15受体α(il15ra或il-15rα)、il-2受体β(il-2rβ，也称il-15rβ或cd122)和γc(也称cd132)。il-15与il-2结构十分相似，同属于螺旋型细胞因子家族。il-15的异三聚体受体与il-2受体共用il-2r/il-15rβ(cd122)和共同γc链(cd 132)。

9、il-15rα作为il-15受体复合物的独特组分，主要在单核细胞和树突状细胞上表达。与其他γc家族细胞因子不同的是，il-15作为细胞因子首先与il-15rα表达细胞结合，然后，il-15/il-15rα复合物递呈给激活的t细胞或nk细胞上的il-2/15rβ和γc。这使得il-15的活性受到限制。il-15突变体(il-15n72d)和il-15rαsu/fc的二聚体蛋白，已被证明在小鼠模型中具有优异的抗肿瘤活性。但仍然存在清除率高，激活外周免疫细胞而产生毒性等缺点。临床使用中，需要具有可以直接结合il-15rβγ受体、并可以直接激活t细胞/nk细胞、同时避免刺激调节性t细胞(treg)的偏向型il-15。

10、il-21于2000年被首次发现，属于细胞因子受体γ链家族，是一种四α螺旋束i型细胞因子。il-21主要由活化的cd4+t细胞、nk细胞、tfh细胞、th17细胞分泌。它通过由il-21r和普通γ链/il-2rγ(也称cd132)组成的受体复合体发出信号。临床中，需要对il-21r亲和力减弱的il-21，以更好的避免潜在的毒性问题。

11、鉴于细胞因子在治疗应用中普遍存在功能多样性和活性受限的问题，亟需发展功能偏向性细胞因子的构建方法，以便于解决临床应用中的问题。本发明提供了一种具有偏向性细胞因子功能的嵌合蛋白及其构建方法，基于此平台可以构建功能偏向型细胞因子以克服细胞因子成药过程中的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于构建一种包括细胞因子和细胞因子受体的嵌合蛋白，从而使该嵌合蛋白可以偏向性结合其他细胞因子受体，进而发挥特异性功能，可以用于临床药物。

2、第一方面，本发明提供了一种用于构建嵌合蛋白的嵌合区域和构建方法，在一些实施方案中，所述的嵌合区域位于细胞因子受体胞外域的柔性连接区，通过在柔性连接区内直接或间接(通过接头元件)嵌入细胞因子，进而达到构建嵌合蛋白的目的。

3、在一些实施方案中，嵌合区域位于细胞因子的柔性连接区，通过在柔性连接区内直接或间接(通过接头元件)嵌入细胞因子受体胞外域，进而达到构建嵌合蛋白的目的。

4、第二方面，基于上述构建嵌合蛋白的嵌合区域，本发明提供了一种嵌合蛋白，该嵌合蛋白包括细胞因子以及细胞因子受体胞外域；该嵌合蛋白充分利用细胞因子受体胞外域是天然存在的可以拮抗细胞因子和其自身相互作用的拮抗剂特性，通过将细胞因子与细胞因子受体胞外域嵌合成嵌合蛋白，从而使嵌合蛋白偏向性结合其他细胞因子受体，进而发挥特异性功能。

5、在一些具体的实施方案中，细胞因子嵌入到细胞因子受体胞外域的嵌合区域中，所述嵌合区域位于细胞因子受体胞外域柔性连接区，所述的嵌合蛋白从n端到c端具有如下所示的多肽结构式：

6、c1-i-c2；

7、式中c1为细胞因子受体胞外域嵌合区域中任一嵌合位点前或后的氨基酸序列或其变体、改造体、截断体或衍生物，c2为细胞因子受体胞外域中除c1外的氨基酸序列或其变体、改造体、截断体或衍生物；i为细胞因子或者细胞因子的变体、改造体、截断体或衍生物。

8、其中，所述的c1、c2至少含有三个氨基酸，或者至少含有一个独立的蛋白质二级结构单元，如α螺旋或者β折叠等。

9、进一步的，在一些实施方式中，所述的c1和c2通过接头元件间接同i连接；所述的嵌合蛋白从n端到c端具有如下所示的多肽结构式：c1-l1-i-l3-c2；上述式中l1，l3为各自独立的接头元件。

10、在一些实施方式中，多肽结构式c1-l1-i-l3-c2中的i在其嵌合位点前或者后的两部分氨基酸序列i1和i2通过接头元件l2连接，即嵌合蛋白从n端到c端具有如下所示的多肽结构式：c1-l1-i1-l2-i2-l3-c2；式中i1为细胞因子嵌合区域中任一嵌合位点前或后的氨基酸序列或其变体、改造体、截断体或衍生物，i2为细胞因子中除i1外的氨基酸序列或其变体、改造体、截断体或衍生物。

11、在一些具体的实施方案中，可以是细胞因子受体胞外域嵌入到该细胞因子的嵌合区域中，所述的嵌合区域位于细胞因子柔性连接区；所述的嵌合蛋白从n端到c端具有如下所示的多肽结构式：

12、i1-c-i2；

13、式中i1为细胞因子嵌合区域中任一嵌合位点前或后的氨基酸序列或其变体、改造体、截断体或衍生物，i2为细胞因子中除i1外氨基酸序列或其变体、改造体、截断体或衍生物；c为细胞因子受体胞外域或者细胞因子受体胞外域的变体、改造体、截断体或衍生物。

14、其中，i1、i2至少含有三个氨基酸，或者至少含有一个独立的蛋白质二级结构单元，如α螺旋或者β折叠等。

15、进一步的，所述的i1和i2通过接头元件间接同c连接，所述的嵌合蛋白从n端到c端具有如下所示的多肽结构式：i1-l1-c-l3-i2；上述式中l1，l3为各自独立的接头元件。

16、进一步的，所述的多肽结构式i1-l1-c-l3-i2中的c在其嵌合位点前或者后的两部分氨基酸序列c1和c2通过接头元件l2连接，即嵌合蛋白从n端到c端具有如下所示的多肽结构式：i1-l1-c1-l2-c2-l3-i2；式中c1为细胞因子受体胞外域嵌合区域中任一嵌合位点前或后的氨基酸序列或其变体、改造体、截断体或衍生物，c2为细胞因子受体胞外域中除c1外的氨基酸序列或其变体、改造体、截断体或衍生物。

17、上述实施例中，接头元件l1、l2、l3可以是相同或不同序列，其可选自序列seq idno:13，seq id no:14，seq id no:15，seq id no:16，seq id no:17，seq id no:18，或其他本领域常用的、具有类似功能的接头元件。

18、在一些实施方式中，嵌合蛋白还包括免疫球蛋白fc区，fc区可以连接在嵌合蛋白的n端也可以放c端，可以直接连接也可以通过接头元件间接连接。免疫球蛋白fc区可以使所述分子形成二聚体，同时延长所述分子的体内半衰期。可用于本发明的fc区可以来自不同亚型的免疫球蛋白，例如，igg(例如，igg1、igg2、igg3或igg4亚型)、iga1、iga2、igd、ige或igm。在一些实施方案中，可以在野生型的fc序列上引入突变用于改变fc介导的相关活性。所述突变包括但不限于：a).改变fc介导的cdc活性的突变；b).改变fc介导的adcc活性的突变；或c).改变fcrn介导的体内半衰期的突变。此类突变描述于下列文献中：leonardgpresta，currentopinioninimmunology2008，20:460-470；esohee.idusogieetal.，jimmunol2000，164:4178-4184；raphaela.clynesetal.，naturemedicine，2000，volume6，number4:443-446；paulr.hintonetal.，jimmunol，2006，176:346-356。

19、在一些实施方案中，fc序列上可以引入突变，从而使得突变的fc更容易形成同二聚体或者异二聚体。如ridgway，prestaetal.1996以及carter2001中提到的利用fc接触界面氨基酸侧链基团空间作用的knob-hole模型，使得不同fc突变之间更容易形成异二聚体；再比如如cn102558355或者cn103388013a中，通过改变fc接触界面氨基酸所带的电荷，进而改变fc接触界面之间的离子相互作用力，使得不同的fc突变对之间更容易形成异二聚体(cn102558355a)，亦或是具有相同突变的fc之间更容易形成同二聚体(cn103388013a)。

20、在一些具体的实施方案中，免疫球蛋白fc区优选是人免疫球蛋白fc区，更优选是人igg1的fc区。在一些具体实施方案中，所述免疫球蛋白fc区的氨基酸序列示于seq idno:20。

21、在一些具体的实施方案中，还包括该嵌合蛋白的衍生物。

22、在一些具体的实施方案中，所述的细胞因子受体为cd25，所述的细胞因子为il-2，il-2嵌入到cd25胞外域的嵌合区域中嵌合成cd25/il-2嵌合蛋白。该cd25/il-2嵌合蛋白或其衍生物具有以下特征中的至少一个：

23、(a)能够自然形成类似于il-2与cd25结合的三维构象；

24、(b)与野生型il-2相比，很大程度降低与cd25的结合或与cd25不结合；

25、(c)与野生型il-2相比，能够保留或增强与cd122的结合；

26、(d)与野生型il-2相比，分子量更大，体内半衰期更长；

27、(e)能够有效激活中等亲和力il-2受体(il-2rβγ)介导的信号；

28、(f)促进cd8+t细胞和nk细胞的活化；

29、(g)促进免疫细胞杀伤肿瘤细胞。

30、在一些具体的实施方案中，所述的细胞因子受体为cd25，所述的细胞因子为il-2，cd25胞外域嵌入到il-2的嵌合区域中，嵌合成il2/cd25嵌合蛋白。该il2/cd25嵌合蛋白或其衍生物具有以下特征中的至少一个：

31、(a)能够自然形成类似于il-2与cd25结合的三维构象；

32、(b)与野生型il-2相比，分子量更大，体内半衰期更长。

33、在一些具体的实施方案中，所述的细胞因子受体为il15ra，所述的细胞因子为il-15，嵌合成il15ra/il-15嵌合蛋白。该il15ra/il-15嵌合蛋白或其衍生物具有以下特征中的至少一个：

34、(a)能够自然形成类似于il-15与il15ra结合的三维构象；

35、(b)与野生型il-15相比，分子量更大，体内半衰期更长。

36、(c)与野生型il-15相比，很大程度降低与il15ra的结合；

37、(d)与野生型il-15相比，能够保留或增强与il15rβ(cd122)的结合；

38、(e)促进nk细胞的活化。

39、在一些具体的实施方案中，所述的细胞因子受体为il-21r，所述的细胞因子为il-21，嵌合成il-21ra/il-21嵌合蛋白。该il-21ra/il-21嵌合蛋白或其衍生物具有以下特征中的至少一个：

40、(a)能够自然形成类似于il-21与il21ra结合的三维构象；

41、(b)与野生型il-21相比，分子量更大，体内半衰期更长。

42、第三方面，本发明提供一种缀合物，包括上述的嵌合蛋白或其衍生物，所述嵌合蛋白或其衍生物直接或通过接头元件间接地与其他模块连接。

43、一些实施例中，所述的其他模块包括抗原结合模块、细胞毒素、放射性同位素、生物活性蛋白质、可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、酶金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或vlp、中任一种或其组合。

44、更优选地，所述抗原结合模块是抗体或抗原结合片段；最优选地，所述抗体或抗原结合片段靶向肿瘤细胞上或肿瘤细胞环境中呈现的抗原。

45、一些实施方式中，所述抗原结合模块靶向肿瘤细胞上呈现的或肿瘤细胞环境中的抗原。一些实施方式中，所述抗原结合模块靶向功能细胞(例如cd8+t细胞、nk细胞、cik细胞、til细胞、巨噬细胞、dc细胞等)上的抗原。

46、一些实施方式中，嵌合蛋白连接于至少一个其他模块。一些实施方式中，嵌合蛋白和其他模块形成融合蛋白，即嵌合蛋白与其他模块共享肽键。一些实施方式中，嵌合蛋白连接于至少一个其他模块，例如第一和第二其他模块。一些实施方式中，其他模块为抗原结合模块。一些实施方式中，嵌合蛋白与第一抗原结合模块共享氨基或羧基端肽键，且第二抗原结合模块与以下共享氨基或羧基端肽键：i)嵌合蛋白或ii)第一抗原结合模块。一些具体的实施方式中，嵌合蛋白与所述第一其他模块共享羧基端肽键，而与所述第二其他模块共享氨基末端肽键。一些实施方式中，所述其他模块是抗原结合模块。所述抗原结合模块可以是抗体或抗原结合片段，包括但不限于免疫球蛋白分子(例如igg(例如igg1)类免疫球蛋白分子)、抗体或其抗原结合片段。一些具体实施方式中，抗体或抗原结合片段选自包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区的多肽复合物、fab、fv、sfv、f(ab’)2、线性抗体、单链抗体、scfv、sdab、sdfv、纳米抗体、肽抗体peptibody、结构域抗体、多特异性抗体(双特异性抗体、diabody、triabody和tetrabody、串联二-scfv、串联三-scfv)、受体结合区和相互作用蛋白结合区。在嵌合蛋白连接于超过一个抗原结合模块例如第一和第二抗原结合模块的情况下，每个抗原结合模块可以独立地选自各种形式的抗体和抗原结合片段，例如，第一抗原结合模块可以是纳米抗体分子，而第二抗原结合模块可以是scfv分子，或第一和第二抗原结合模块中的每一个都是纳米抗体分子，或第一和第二抗原结合模块中的每一个是fab分子。一些实施方式中，在嵌合蛋白连接于超过一个抗原结合模块例如第一和第二抗原结合模块的情况下，能独立地选择每个抗原结合模块所针对的抗原，例如，所述第一和所述第二抗原结合模块针对不同的抗原或针对同一抗原。

47、一些实施方式中，所述抗原结合模块结合的抗原可以选自下组：生腱蛋白c的a1域(tnca1)、生腱蛋白c的a2域(tnca2)、纤连蛋白的外域(extradomainb)(edb)、癌胚抗原(cea)和黑素瘤有关的硫酸软骨素蛋白聚糖(mcsp)。一些实施方式中，肿瘤抗原包括但不限于mage、mart-1/melan-a、gp100、二肽基肽酶iv(dppiv)、腺苷脱氨酶结合蛋白(adabp)、亲环素(cyclophilin)b、结肠直肠有关的抗原(crc)-c017-1a/ga733、癌胚抗原(cea)及其免疫原性表位cap-1和cap-2、etv6、aml1、前列腺特异性抗原(psa)及其免疫原性表位psa-1、psa-2和psa-3、前列腺特异性膜抗原(psma)、t细胞受体/cd3-zeta链、肿瘤抗原的mage家族(例如mage-a1、mage-a2、mage-a3、mage-a4、mage-a5、mage-a6、mage-a7、mage-a8、mage-a9、mage-a10、mage-a11、mage-a12、mage-xp2(mage-b2)、mage-xp3(mage-b3)、mage-xp4(mageb4)、mage-c1、mage-c2、mage-c3、mage-c4、mage-c5)、肿瘤抗原的gage家族(例如gage-1、gage-2、gage-3、gage-4，gage-5，gage-6，gage-7，gage-8，gage-9)、bage、rage、lage-1、nag、gnt-v、mum-1、cdk4、酪氨酸酶、p53、muc家族、her2/neu、p21ras、rcas1、α-胎蛋白、e-钙粘蛋白、α-连环蛋白(catenin)、β-连环蛋白和γ-连环蛋白、p120ctn、gp100pmel117、prame、ny-eso-1、cdc27、腺瘤样结肠息肉蛋白(adenomatouspolyposiscoliprotein，apc)、胞衬蛋白(fodrin)、连接蛋白(connexin)37、ig独特型、p15、gp75、gm2和gd2神经节苷脂、病毒产物如人乳头状瘤病毒蛋白、肿瘤抗原的smad家族、lmp-1、p1a、ebv编码的核抗原(ebna)-1、脑糖原磷酸化酶、ssx-1、ssx-2(hom-mel-40)、ssx-1、ssx-4、ssx-5、scp-1和ct-7、以及c-erbb-2。一些实施方式中，病毒抗原的非限制性例子包括流感病毒血凝素、epstein-barr病毒lmp-1、丙肝病毒e2糖蛋白、hivgp160和hivgp120。一些实施方式中，ecm抗原的非限制性例子包括多配体聚糖(syndecan)、类肝素酶(heparanase)、整联蛋白、骨桥蛋白(osteopontin)、link、钙粘蛋白、层粘连蛋白、egf型层粘连蛋白、凝集素、纤连蛋白、notch、生腱蛋白和matrixin。

48、第四方面，本发明公开了一种药物组合物，包括上所述的嵌合蛋白或其衍生物或上述的缀合物以及药学上可接受的稀释剂、载体或助剂。所述药物组合物可以为冻干制剂或可注射溶液。

49、第五方面，本发明提供了一种编码上述嵌合蛋白或其衍生物的核酸分子。本发明的核酸可为rna、dna或cdna。

50、在一个实施例中，所述核酸分子的核苷酸序列如seq id no:24所示，对应的氨基酸序列如seq id no:10所示；

51、在另一个实施例中，所述核酸分子的核苷酸序列如seq id no:25所示，对应的氨基酸序列如seq id no:11所示；

52、在另一个实施例中，所述核酸分子的核苷酸序列如seq id no:26所示，对应的氨基酸序列如seq id no:12所示；

53、第六方面，本发明提供含有上述嵌合蛋白或其衍生物的核酸序列的表达载体。所述载体可以是真核表达载体、原核表达载体、病毒载体。

54、在一个实施例中，表达载体上的cd25/il-2嵌合蛋白可以包含n端信号肽序列，如序列seq id no:19，c端含铰链区的fc序列，如序列seq id no:20。

55、在一些实施方案中，所述的表达载体是病毒载体，可以产生具有生理功能的病毒，如常见的一些溶瘤病毒：单纯疱疹病毒(hsv)、腺病毒、牛痘病毒和呼肠弧病毒等。

56、第七方面，本发明涉及表达或能够表达一种或多种本发明的嵌合蛋白和/或含有本发明的核酸或载体的宿主细胞。本发明的优选宿主细胞为细菌细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。

57、适合的细菌细胞包括但不限于革兰氏阴性细菌菌株(例如大肠杆菌(escherichiacoli)菌株、变形杆菌属(proteus)菌株及假单胞菌属(pseudomonas)菌株)及革兰氏阳性细菌菌株(例如芽孢杆菌属(bacillus)菌株、链霉菌属(streptomyces)菌株、葡萄球菌属(staphylococcus)菌株及乳球菌属(lactococcus)菌株)的细胞。

58、适合的真菌细胞包括但不限于木霉属(trichoderma)、脉孢菌属(neurospora)及曲菌属(aspergillus)的物种的细胞；或者包括酵母属(saccharomyces)(例如酿酒酵母(saccharomycescerevisiae))、裂殖酵母属(schizosaccharomyces)(例如粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe))、毕赤酵母属(pichia)(例如巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)及嗜甲醇毕赤酵母(pichiamethanolica))及汉森酵母属(hansenula)的物种的细胞。

59、适合的哺乳动物细胞包括但不限于hek293细胞、cho细胞、bhk细胞、hela细胞、cos细胞等。

60、然而，本发明也可使用两栖类细胞、昆虫细胞、植物细胞及本领域中用于表达异源蛋白的任何其他细胞。

61、一些实施方案中，所述的宿主细胞是能够表达本发明的嵌合蛋白或其衍生物的功能细胞(如：car-t、car-nk、cd8+t细胞、nk细胞、cik细胞、til细胞、巨噬细胞、dc细胞等)，所述的功能细胞具有以下任一种或多种生理功能：肿瘤杀伤、病原清除、免疫效应等。

62、第八方面，本发明提供了本发明所述嵌合蛋白或其衍生物、核酸分子、宿主细胞、免疫缀合物及药物组合物用于制备治疗相关疾病(如增生性疾病、免疫性疾病等)、调节t细胞介导的免疫应答、刺激个体免疫系统的药物中的用途。所述增生性疾病可以是肿瘤或癌(例如转移性肿瘤或癌)，可以是实体瘤(例如转移性肾细胞癌和恶性黑素瘤)。

63、一些实施方式中，本发明公开的嵌合蛋白或其衍生物、免疫缀合物、药物组合可用于治疗刺激宿主的免疫系统以获益的疾病情形，特别是期望增强细胞免疫应答的状况，可以包括宿主免疫应答不足或缺陷性的疾病情形。一些实施方式中，施嵌合蛋白或其衍生物、免疫缀合物的疾病情形包括细胞免疫应答是特异性免疫的关键机制的肿瘤或感染，例如癌症(例如肾细胞癌或黑素瘤)、免疫缺陷(例如hiv阳性患者中、免疫受抑制的患者)、慢性感染等。一些实施方式中，增强细胞免疫应答可以包括以下任一种或多种：免疫功能的一般升高、t细胞功能升高、b细胞功能升高、淋巴细胞功能的恢复、il-2受体表达提高、t细胞应答性提高、天然杀伤细胞活性或淋巴因子激活的杀伤(lak)细胞活性升高等。

64、一些实施方式中，本发明公开的嵌合蛋白或其衍生物、免疫缀合物、药物组合用于治疗的疾病是增殖性病症，例如癌症。癌症的非限制性例子包括膀胱癌、脑癌、头和颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、子宫内膜癌、食道癌、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、胃癌、前列腺癌、血液癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、骨癌和肾癌。其它可使用本公开的嵌合蛋白或其衍生物治疗的细胞增殖病症包括但不限于位于以下处的新生物：腹部、骨、乳房、消化系统、肝、胰、腹膜、内分泌腺(肾上腺、副甲状腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼、头和颈、神经系统(中枢和外周)、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾、胸部、和泌尿生殖系统。还包括癌症前期状况或损伤以及癌症转移。在某些实施方式中，癌症选自下组：肾细胞癌、皮肤癌、肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、脑癌、头和颈癌。类似地，其它细胞增殖病症也可用本公开的嵌合蛋白或其衍生物治疗，包括但不限于：高丙种球蛋白血症(hypergammaglobulinemia)、淋巴增生性病症、病变蛋白血症(paraproteinemias)、紫癜(purpura)、结节病、塞扎里综合征(sezarysyndrome)、waldenstron's巨球蛋白血症、高歇氏病(gaucher'sdisease)、组织细胞增多病(histiocytosis)以及任何其它位于上文所列的器官系统中的瘤形成(neoplasia)外的细胞增殖疾病。在另一些实施方式中，所述疾病涉及自身免疫性、移植排斥、外伤后免疫应答和传染性疾病(例如hiv)。

65、一些实施方式中，提供其中每日至少2次、每日至少1次、每48小时至少1次、每72小时至少一次、每周至少一次、每2周至少一次、每个月至少一次、每2个月至少一次或每3个月至少一次向受试者施用嵌合蛋白或其衍生物、免疫缀合物的方法。可通过任何有效途径施用嵌合蛋白或其衍生物、免疫缀合物。在一些实施方式中，通过肠胃外注射包括皮下注射施用嵌合蛋白或其衍生物、免疫缀合物。具体实施方式涉及包含药学上可接受的量的嵌合蛋白或其衍生物、免疫缀合物(例如，治疗有效量)(包括上述的那些试剂)连同一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂(例如，等渗注射溶液)的药物组合物。所述药物组合物通常为适于人施用的药物组合物。此外，在一些实施方式中，所述药物组合物包含至少一种另外的预防剂或治疗剂。一些实施方式含有上述药物组合物之一和任选地一种或多种另外的组分的无菌容器。

66、第九方面，本发明提供了一种试剂盒，所述的试剂盒包含本发明的嵌合蛋白、其衍生物、缀合物、药物组合物、核酸分子、表达载体或宿主细胞，以及使用说明。试剂盒一般包括表明试剂盒内容物的预期用途的标签。术语标签包括在试剂盒上或与试剂盒一起提供的或以其他方式随试剂盒提供的任何书面的或记录的材料。

67、第十方面，本发明提供了一种嵌合蛋白或其衍生物的构建和生产方法，包括在适于表达所述嵌合蛋白或其衍生物的条件下或使用前述核酸分子，或使用前述表达载体，或使用前述宿主细胞进行表达。