与小麦籽粒硬度紧密连锁的分子标记及其应用

本发明涉及小麦育种和分子生物学领域，特别是一种与小麦籽粒硬度指数qtl紧密连锁的分子标记及其应用。

背景技术：

1、小麦籽粒硬度是指破坏小麦籽粒所受到的阻力，是影响小麦商品分类分级、小麦加工制粉工艺以及小麦面粉最终加工用途的重要指标。硬质麦由于胚乳淀粉颗粒与蛋白质基质结合紧密，制粉时籽粒不易研碎，主要沿胚乳细胞壁方向破裂，胚乳与糊粉层分离，形成较粗的粉粒，易于流动和筛理，润麦加水量和出粉率高；软质麦淀粉颗粒与蛋白质之间结合力弱，制粉时籽粒易于研碎，主要在胚乳淀粉和蛋白基质间发生分离，粉粒较细，较难流动和筛理，润麦加水量和出粉率低。硬质麦不仅具有优良制粉特性，通常情况下，其蛋白含量高，磨制的面粉颗粒度大，破损淀粉含量多，吸水性强，形成的面团强度大、弹性好，适于加工面包、面条和水饺等产品；软质麦蛋白含量较低，磨制的面粉颗粒度小，破损淀粉含量低，吸水能力差，形成的面团强度小，适于制作饼干、蛋糕、酥饼等粉质疏松产品(郑雅月,赵振杰,赵万春,董剑,李晓燕,高翔.小麦籽粒硬度研究进展.麦类作物学报,2017,37(7):915-922)。因此，开展小麦籽粒硬度遗传机制的研究对小麦品质改良和加工应用具有重要意义。

2、遗传分析发现，自然群体和双亲分离群体中的小麦籽粒硬度是呈连续分布的，表明该性状是受多基因控制的数量性状。位于5d染色体短臂的hardness locus(ha)位点是决定籽粒硬度的主效基因位点，分子生物学的研究表明，该位点包括pina、pinb和gsp-1(grain softness protein-1)基因，pina和(或)pinb基因的突变是导致籽粒硬度增加的主要原因。但采用ha位点相同的双亲配制的分离群体进行籽粒硬度分析发现，除了ha位点外，还存在其他控制籽粒硬度的主效qtl位点。迄今为止，除了3d染色体外，其余染色体均发现控制籽粒硬度的qtl位点(tu m and li y.toward the genetic basis and multipleqtls ofkernel hardness in wheat.plants,2020,9:1631)。

3、目前常用的籽粒硬度测定主要采用3种方法：颗粒度指数法(particle sizeindex，psi)、近红外反射光谱法(near-infraredreflectance spectroscopy，nirs)以及单籽粒谷物特性测定仪法(single-kernel characterization system，skcs)。相对于前两种方法依赖于面粉的颗粒度，skcs法直接对小麦籽粒压碎测定，短时间可以处理大量样品且重复性好，因而被广泛使用，skcs法获得的是籽粒硬度指数，籽粒硬度指数越高，预示籽粒越硬，籽粒硬度指数越低，预示籽粒越软。

4、常用的小麦籽粒硬度筛选方法大多采用小麦成熟收获的小麦籽粒进行，不仅要对籽粒进行破碎，而且必须小麦成熟晒干后才能进行，在小麦育种过程中对大量植株的筛选淘汰，也是大量人力和物力的浪费。采用与小麦籽粒硬度指数紧密连锁的分子标记，可通过对苗期小麦植株dna的扩增获得目标植株，直接在苗期淘汰非目标植株，减少人力和物力的投入，缩短筛选时间，提高选择效率。

技术实现思路

1、本发明提供一种检测小麦植株是否存在与小麦品种西风降低籽粒硬度指数qtl紧密连锁的分子标记，判断小麦植株是否含有降低籽粒硬度指数qtl，进而预测小麦植株籽粒硬度指数，加快小麦籽粒硬度的选择进度。

2、本技术提供的具体技术方案如下：

3、首先，本技术提供了一种与小麦低籽粒硬度紧密连锁的分子标记，所述分子标记是以西风小麦叶片dna为模板，以核苷酸序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示的引物对为引物进行pcr扩增，获得扩增产物后，再以质量分数为1.5％琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物获得的大小为331bp的dna片段。申请人将该片段自命名为kh5d-331，该标记位于小麦5d染色体，与新发现影响籽粒硬度qtl紧密连锁，该qtl与已报道影响小麦籽粒硬度基因均不同。

4、优选的，上述质量分数为1.5％琼脂糖凝胶是指100ml琼脂糖溶液中含有1.5g琼脂糖；

5、上述小麦叶片dna为模板是以小麦植株的叶片分离获取的dna，该叶片dna提取方法为本领域常规方法，如采用ctab方法提取(参见文献：saghai-maroofma,soliman k,jorgensen ra,allard rw.ribosomal dna spacerlength polymorphisms in barley：medelian inheritance chromosome location andpopulation dynamics.proc natlacadsci usa,1984,81(24):8014-8018)。

6、上述pcr扩增是指：

7、pcr反应体系：每20ul反应体系包括：10×buffer 2μl，终浓度为1.5mm的mgcl2，终浓度为0.2mm的dntps，核苷酸序列如seq id no.1所示的引物i终浓度为0.25μm，核苷酸序列如seq id no.2所示的引物ii终浓度为0.25μm，模板dna 50ng，余量为ddh2o。

8、pcr运行程序：94℃预变性5min；然后94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，共35个循环；最后72℃延伸5min，获得扩增产物。

9、其次，本技术提供了一种小麦品种或品系籽粒硬度及籽粒硬度指数的预测方法，其具体步骤为：以样品小麦植株叶片dna为模板，以核苷酸序列分别如seq id no.1和seqid no.2所示的引物对为引物进行pcr扩增，获得扩增产物后，将扩增产物进行琼脂糖凝胶(质量分数为1.5％)电泳，若电泳产物存在大小为331bp的条带，则预测含有该条带的样品小麦籽粒硬度/籽粒硬度指数低于不含该条带的小麦，含有该条带的样品小麦硬度指数平均降低20％左右。

10、上述pcr扩增是指：

11、pcr反应体系：总体积20ul，包括10×buffer 2μl，终浓度为1.5mm的mgcl2，0.2mm的dntps，核苷酸序列如seq id no.1所示的引物i终浓度为为0.25μm，核苷酸序列如seq idno.2所示的引物ii终浓度为0.25μm，模板dna 50ng，余量为ddh2o。

12、pcr运行程序：94℃预变性5min；然后94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，共35个循环；最后72℃延伸5min，获得扩增产物。

13、上述样品小麦品种优选为西风及西风的衍生品种或品系；所述西风的衍生品种或品系是指：以小麦西风为亲本，通过常规杂交或采用玉米与小麦杂交诱导单倍体，再用秋水仙素加倍获得双单倍体的小麦品种或品系。

14、第三，本发明还提供了一对用于检测小麦籽粒硬度紧密连锁分子标记的引物对，该引物对的核苷酸序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示。

15、本发明同时提供了上述核苷酸序列如seq id no.1和seq id no.2所示引物对在检测小麦籽粒硬度及籽粒硬度指数中的应用，其具体步骤为：将小麦植株叶片dna为模板，以seq id no.1和seq id no.2为引物进行pcr扩增；然后将扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，若电泳产物存在大小为331bp的条带，则说明该样品带有分子标记kh5d-331，则预测含有该条带的样品小麦籽粒硬度/籽粒硬度指数低于不含该条带的小麦，该样品小麦硬度指数平均降低20％左右。

16、pcr反应体系：总体积20ul，包括10×buffer 2μl，终浓度为1.5mm的mgcl2，终浓度为0.2mm的dntps，核苷酸序列如seq id no.1所示的引物i终浓度为0.25μm，核苷酸序列如seq id no.2所示的引物ii终浓度为0.25μm，模板dna 50ng，余量为ddh2o。

17、pcr运行程序：94℃预变性5min；然后94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，共35个循环；最后72℃延伸5min，获得扩增产物。

18、本技术中，术语“籽粒硬度”是指破坏小麦籽粒所受到的阻力；术语“籽粒硬度指数”是指采用perten skcs4100单籽粒谷物特性测定仪对300粒压碎测定获得的数值。一般认为二者为正相关，即“籽粒硬度指数”高的小麦“籽粒硬度”较高。

19、本技术利用软质小麦西风与硬质小麦扬麦158配制了重组自交系群体，采用55k芯片技术进行基因型分析，结合4年的群体籽粒硬度指数表型资料，定位了影响小麦籽粒硬度指数qtl，在5d染色体发现了一个与pina或pinb基因不同位点的控制小麦籽粒硬度指数的主效qtl，该qtl最高可解释15.2％的籽粒硬度指数变异，利用与该qtl紧密联锁的snp标记信息，申请人设计了可用于一般实验室检测的常规pcr引物，使用该引物pcr扩增获得的分子标记可用于以西风为杂交亲本的小麦后代的籽粒硬度筛选。

20、本发明克服常规育种中小麦籽粒硬度鉴定易受环境影响，并且只能在特定生育时期鉴定筛选的缺点，在苗期就可通过检测分子标记对小麦籽粒硬度进行预测和筛选，淘汰非目标植株，减少人力物力的浪费，提高育种效率；此外，本发明使用的分子标记为pcr标记，简单易操作，pcr扩增稳定，便于不同单位和一般实验室使用。