一种从人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞球及其制备方法和应用与流程

本发明涉及细胞生物学领域，特别涉及一种从人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞球及其制备方法和应用。

背景技术：

1、心肌疾病是现代社会发病率和致死率最高的重大疾病之一。据了解，心肌细胞是分化程度极高的终末细胞，成年人的心肌细胞几乎不具备分裂增殖的能力。在发生诸如急性心肌梗死、代谢障碍、病毒性心肌炎等多种造成心脏损伤的疾病后，会导致数以万计的心肌细胞的不可逆的死亡，引起心脏结构重塑和心功能的下降，至今仍缺少有效的治疗方式。目前，用正常的心肌细胞移植替换已经坏死的细胞是从根本上治疗这类心脏病的方法之一，但是，心肌细胞来源的不足大大限制了心肌细胞临床应用的发展。

2、人诱导性多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hipsc)是通过体细胞重编程得到类似胚胎干细胞特性的一种细胞。研究表明，hipsc具有分化成各类功能细胞的能力，有望解决心肌细胞用于治疗疾病过程中的细胞资源短缺的问题。现已报道的利用干细胞分化心肌细胞的各种方法使用2d培养的hipsc在2d培养条件下完成分化，存在心肌细胞分化工艺稳定性差、所需成本较高、不容易规模化和自动化生产等问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种在悬浮培养条件下从人诱导性多能干细胞分化得到的心肌细胞球的制备方法，该制备方法能够在悬浮培养条件下高效地利用人诱导性多能干细胞分化获得纯度好、活率高、功能完善的心肌细胞球，且避免了使用2d培养和分化方式，所用到的培养体系不含动物源成份，无需滋养层细胞，易于实现工艺稳定、进行生产工艺放大和工业化生产心肌细胞球和心肌细胞以满足药物研发、心脏相关疾病临床研究和治疗需求。

2、第一方面，本发明提供了一种从人诱导性多能干细胞分化得到的心肌细胞球的制备方法，包括以下步骤：

3、(1)提供人诱导性多能干细胞单细胞悬液，接种于培养皿、培养瓶或者反应器中培养48小时，形成聚集体；

4、(2)替换并使用第一分化培养基培养20-24小时，以诱导细胞分化；其中，所述第一分化培养基为包含7-8μm chir99021的cdm3基础培养基；

5、(3)弃去所述第一分化培养基，添加第二分化培养基培养48-56小时，所述第二分化培养基为包含4-6μm wnt-c59的cdm3基础培养基；

6、(4)弃去所述第二分化培养基，换成cdm3基础培养基培养至第8-10天，且每隔48小时换液；

7、(5)弃去步骤(4)所述cdm3基础培养基，添加纯化培养基培养至第14天，每隔48小时换液；

8、(6)弃去所述纯化培养基，换成cdm3基础培养基培养，且每隔48小时换液，培养到第18-20天时，收集得到成熟的心肌细胞球。

9、可选地，所述人诱导性多能干细胞(hipscs)可以是商品化的细胞系，也可以是由供体细胞诱导而来，所述供体细胞可以但不限于包括绒毛细胞、成纤维细胞、神经干细胞、肝细胞、间质干细胞、外周血细胞、乳腺上皮细胞、脂肪干细胞、尿液细胞、皮肤细胞中的一种或多种。

10、本发明中，所述人诱导性多能干细胞单细胞悬液是通过使用温和细胞解离试剂(gcdr)将hipscs解离成单个细胞，重悬获得。

11、可选地，所述cdm3基础培养为含0.2-0.25g/l l-抗坏血酸、0.4-0.6g/l重组人白蛋白和4-5g/l d-葡萄糖的rpmi-1640培养基。

12、本发明中，所述步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)和步骤(6)中的cdm3基础培养基都是相同的培养基；其中，第一分化培养基由chir99021和cdm3基础培养基组合配制而成，所述第二分化培养基由wnt-c59和cdm3基础培养基组合配制而成。

13、可选地，所述纯化培养基为含0.2-0.25g/l l-抗坏血酸、0.4-0.6g/l重组人白蛋白和3.5-4.5mm l-乳酸的rpmi-1640培养基。本发明步骤(5)中，纯化培养基能够纯化制备得到的人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞球(hipsc-cms)，进一步提高制备方法中hipsc-cms的纯度。

14、可选地，所述步骤(4)的所述换成cdm3基础培养基培养至第8-10天时，开始分化得到具有节律跳动的细胞球。

15、本发明中，在制备的第8-10天，诱导分化的细胞中能开始出现具有节律跳动的hipsc-cms，然后继续开展步骤(5)的过程。

16、本发明中，所述步骤(4)中的第8-10天、步骤(5)中的第14天和步骤(6)中的第18-20天，都是连续的时间线，均以步骤(1)为第0天起始。

17、可选地，在所述步骤(1)中，使用mtesrtm3d培养基培养接种后的所述人诱导性多能干细胞，所述mtesrtm3d培养基包含10μm y-27632。

18、其中，所述mtesrtm3d培养基可以但不限于商品化的培养基。所述y-27632(或y27632)是一种rock的选择性抑制剂，一种高效的、细胞可渗透的、可逆的、选择性的rho相关蛋白激酶抑制剂。通过采用含有y-27632的mtesrtm3d培养基可提高分化步骤(1)中hipsc的存活率。

19、可选地，所述步骤(1)-(6)的细胞培养方式为悬浮培养，均置于37℃和5％co2环境下的旋转摇床上培养，所述旋转摇床的旋转速度为30-90转/分钟。

20、进一步地，可选地，所述步骤(1)-(6)的细胞培养均置于37℃和5％co2环境下的旋转摇床上培养；其中，步骤(1)-(3)中，所述旋转摇床的旋转速度为60-70转/分钟，步骤(4)和(5)中，所述旋转摇床的旋转速度为80-85转/分钟，步骤(6)中，所述旋转摇床的旋转速度为70-80转/分钟。

21、本发明中，在制备过程中不同阶段使用不同旋转速度有利于细胞增长及分化，以获得纯度好、活率高、功能完善的心肌细胞球。随着培养时间增长，细胞球直径逐渐增大，制备过程中提高转速可以防止细胞球之间相互黏连，当细胞已高度分化且不再增殖时，通过适当降低转速有利于进行纯化培养。

22、可选地，所述接种于培养皿、培养瓶或者反应器中的所述人诱导性多能干细胞密度为1.0×105-3.0×105个/ml。

23、进一步地，所述人诱导性多能干细胞单细胞悬液的细胞接种密度为1.0×105个/ml，或为1.5×105个/ml，或为2.0×105个/ml，或为2.5×105个/ml，或为3.0×105个/ml。本发明中，适宜细胞接种密度更加有利于细胞在培养条件下的诱导分化。

24、本发明中，所述培养皿、培养瓶或者反应器泛指用于细胞培养的容器或器皿，可以但不限于是孔板、培养瓶、培养盘和反应器中的一种或多种。优选地，所述培养器皿可以为超低吸附的6孔板、96孔板、10cm细胞培养皿及环形细胞培养皿中的至少一种。

25、本发明第一方面所提供了一种从人诱导性多能干细胞分化得到的心肌细胞球的制备方法，该制备方法在悬浮培养条件下高效地利用人诱导性多能干细胞分化获得纯度好、活率高、功能完善的心肌细胞球，且避免了使用2d培养和分化方式，所用到的培养体系不含动物源成份，无需滋养层细胞，易于实现工艺稳定、进行生产工艺放大和工业化生产心肌细胞球。所述从人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞球具有完善生物学活性及功能。

26、第二方面，本发明还提供了一种从本发明第一方面所述的方法制备得到的从人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞球。

27、本发明制备得到的成熟的心肌细胞具有纯度好、活性高的特点，其特异结构基因高表达，能够高表达心肌肌钙蛋白(ctnt)。制备得到的心肌细胞球具有正常心肌细胞的生物学活性及功能，能够自主且节奏规律地跳动，在实验室条件下可以持续跳动超过120天。

28、本发明第二方面提供的从人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞球，具有纯度好、活率高、功能完善的特点，能够表现出稳定的心肌细胞活性，可广泛应用于体外心肌细胞各种临床测试，并且能满足于药物研发、心脏相关疾病临床研究和治疗需求，具有深远的研究意义。

29、第三方面，本发明还提供了一种由本发明第一方面所述的制备方法制备的或由第二方面所提供的从人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞球在制备预防、诊断和治疗心脏疾病的药物中的应用。

30、可选地，所述心脏疾病可以但不限于包括心肌梗塞、缺血性心脏病、淤血性心力衰竭、肥大型心肌病、扩张型心肌病、心肌炎和慢性心力衰竭中的一种或多种。

31、本发明中，所述应用可以但不限于为检测试剂盒、靶向药物载体或是在药物筛选模型中的应用。

32、本发明第三方面的所述应用中，通过采用本发明第一方面所述的制备方法制备的或由第二方面所提供的从人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞球，由于所述制备方法的高效，以及制备得到的心肌细胞具有纯度好、活率高、功能完善的特点，可以极大地丰富基于本发明提供的从人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞球的应用范围，具有极大的研究和临床应用价值。

33、第四方面，本发明还提供了一种由本发明第一方面所述的制备方法制备的或由第二方面所提供的从人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞球在具有心脏疾病小鼠模型中研究心脏疾病治疗方法的应用。

34、可选地，所述心脏疾病可以但不限于包括心肌梗塞、缺血性心脏病、淤血性心力衰竭、肥大型心肌病、扩张型心肌病、心肌炎和慢性心力衰竭中的一种或多种。

35、本发明第四方面的所述应用中，小鼠模型是一种常见实验模型，构建的心脏疾病小鼠模型可以用于模拟其他哺乳动物，尤其是人类的对应疾病模型，有利于研究心肌细胞的功能和作用，同样具备重要的研究价值。