口蹄疫病毒A型ELISA抗体检测试剂盒及其制备方法与应用与流程

本发明属于生物工程，涉及一种口蹄疫病毒a型elisa抗体检测试剂盒及其制备方法与应用。

背景技术：

1、口蹄疫病毒包括7种血清型，目前我国主要流行o型和a型，两类病毒结构蛋白氨基酸序列相似度高，因此开发口蹄疫病毒结构蛋白抗体检测试剂盒的最主要难点在于避免与不同血清型的抗体非特异反应，尤其目前我国在临床使用的口蹄疫a型疫苗均与o型疫苗构成多价疫苗，包括口蹄疫病毒oa二价灭活疫苗、口蹄疫病毒oa二价合成肽疫苗，这对试剂盒的检测特异性提出更高要求。

2、对现有专利文献进行检索发现，cn109485703a公开了一种口蹄疫a型结构蛋白vp1抗原表位多肽及其应用；cn106432434a公开了一种口蹄疫a型结构蛋白vp1抗体酶联免疫检测试剂盒。该专利涉及口蹄疫a型病毒结构蛋白vp1抗原表位多肽，为序列a(tyr asn glythr thr lys tyr ser thr gly asn ala gly arg arg gly asp leu gly ser leu alaala arg val ala ala gln leu pro ala ser phe asn phe gly ala ile arg ala)、序列b(val tyr asn gly thr ser lys tyr ser ala pro ala thr arg arg gly asp leu glyser leu ala ala arg leu ala ala gln leu pro ala ser phe asn tyr gly ala ilearg ala)、序列c(val tyr ser gly thr ser lys tyr sera la ser gln asn arg arggly asp leu gly pro leu ala ala arg leu ala ala gln leu pro ala ser phe asnphe gly ala ile arg ala)中一种或几种组成的混合多肽，以及多肽在制备检测感染或免疫后产生的口蹄疫a型病毒结构蛋白vp1抗体的试剂盒中的应用。

3、其缺点在于，在验证特异性反应时，并未验证对目前市场上正在使用的猪口蹄疫o型合成肽疫苗(多肽2600+2700+2800)免疫抗体交叉反应。事实上，所设计多肽与口蹄疫o型病毒对应位置(如口蹄疫o型病毒re-o/mya98/jscz/2013株对应gh环序列为valtyrasnglylyscyslystyralaglyglyserleuproasnvalargglyaspleuglnvalleuala glnlysalaalaargproleuprothrserpheasntyrglyalailelysala)存在完全一致的序列(如斜体部分序列)，尤其涉及n末端和c末端序列。而事实上本发明试验发现，该发明所选多肽序列a(对应本发明说明书表1paf7204)、序列b(对应本发明说明书表1pwh0904)、序列c(对应本发明说明书表1pmm1304)的确能与猪口蹄疫o型合成肽疫苗抗体非特异结合，在临床应用中将导致假阳性反应，阻碍临床评价疫苗真实免疫效果。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供一种口蹄疫病毒a型elisa抗体检测试剂盒及其制备方法与应用。本发明通过确定口蹄疫a型病毒gh环位置与猪口蹄疫o型合成肽疫苗和猪口蹄疫o型灭活疫苗抗体非特异结合的序列，通过序列缩减有效解决非特异结合问题。但是缩减后对a型抗体的检测敏感性明显降低，因此进一步通过多聚抗原肽的形式展示多肽提高检测敏感性。最终确定多肽表位组合、含多肽表位组合的抗原包被板以及elisa抗体检测试剂盒。

2、本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

3、本发明提供一条口蹄疫病毒a型表位多肽，所述多肽的氨基酸序列如序列1所示，序列1：(vyngtskysapatrrgdlgslaarlaaqlpasgss)2k。

4、还提供一条口蹄疫病毒a型表位多肽，所述多肽的氨基酸序列如序列2所示，序列2：(vysgtskysapqnrrgdsgplaarlaaqlpasgss)2k。

5、还提供一条口蹄疫病毒a型表位多肽，所述多肽的氨基酸序列如序列3所示，序列3：(vyngttkystgnagrrgdlgslaarvaaqlpasgss)2k。

6、本发明还提供一种抗原包被板，所述包被板含有3条表位多肽，所述多肽的氨基酸序列如下：

7、序列1：(vyngtskysapatrrgdlgslaarlaaqlpasgss)2k；

8、序列2：(vysgtskysapqnrrgdsgplaarlaaqlpasgss)2k；

9、序列3：(vyngttkystgnagrrgdlgslaarvaaqlpasgss)2k。

10、本发明还提供一种抗原包被板的制备方法，所述方法包括如下步骤：

11、s1、分别采用固相合成法合成所述表位多肽；

12、s2、将3种表位多肽混合，稀释后加入酶联反应板孔中进行包被、封闭、干燥处理，即得所述抗原包被板。

13、作为一个实施方案，步骤s1中，序列1的合成包括如下步骤：

14、1)合成得到全保护肽段1：

15、fmoc-val-tyr(tbu)-asn(trt)-gly-thr(tbu)-ser(tbu)-lys(boc)-tyr(tbu)-ser(tbu)-ala-pro-oh(保护肽片段1)；

16、2)合成得到保护肽段2：

17、fmoc-ala-thr(tbu)-arg(pbf)-arg(pbf)-gly-asp(otbu)-leu-gly-ser(tbu)-leu-ala-oh(保护肽片段2)；

18、3)合成得到保护肽段3：

19、h-ala-arg(pbf)-leu-ala-ala-gln(trt)-leu-pro-ala-ser(tbu)-gly-ser(tbu)-ser(tbu)-lys(h-ala-arg(pbf)-leu-ala-ala-gln(trt)-leu-pro-ala-ser(tbu)-gly-ser(tbu)-ser(tbu)-)-rink amide mbha resin(保护肽树脂片段3)；

20、4)在保护肽段3的nmp溶液中，加入保护片段2/hobt/dic的活化片段进行偶联反应，反应完全后(kaiser test阴性),以哌啶脱除肽树脂上的fmoc，nmp洗涤后再加入保护片段1/pybop/dipea的活化片段进行偶联反应，反应完全后(kaiser test阴性),以哌啶脱除肽树脂上的fmoc，得到全保护的序列1肽树脂；

21、5)在序列1肽树脂中脱除固相载体及氨基酸侧链保护基团，沉淀得到完整多肽(vyngtskysapatrrgdlgslaarlaaqlpasgss)2k的粗肽样品；纯化得到完整序列1多肽。

22、优先的，步骤1)包括：先合成肽树脂：

23、fmoc-val-tyr(tbu)-asn(trt)-gly-thr(tbu)-ser(tbu)-lys(boc)-tyr(tbu)-ser(tbu)-ala-pro-2-chlorotrityl resin；去除固相载体，得到全保护肽段。

24、所述合成肽树脂具体为：以2-chlorotrityl resin为固相载体，二异丙基乙基胺(dipea)为催化剂，将fmoc-pro-oh连接上树脂形成fmoc-pro-2-chlorotrityl resin，再以25％哌啶(pip)/nmp脱除fmoc形成h-pro-2-chlorotrityl resin，nmp洗涤去除残余哌啶后，加入fmoc-ala-oh/pybop/dipea活化氨基酸偶联形成fmoc-ala-pro-2-chlorotritylresin，nmp洗涤残余氨基酸后再脱除fmoc，循环偶联、洗涤、脱除fmoc及洗涤步骤，依次偶联fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-val-oh，最终形成

25、fmoc-val-tyr(tbu)-asn(trt)-gly-thr(tbu)-ser(tbu)-lys(boc)-tyr(tbu)-ser(tbu)-ala-pro-2-chlorotrityl resin。

26、步骤1)中，所述肽树脂以1％三氟乙酸(tfa)/二氯甲烷(dcm)处理去除固相载体，得到所述全保护肽段。

27、优选的，步骤3)具体为：以rink amide mbha resin为固相载体，加入fmoc-lys(fmoc)-oh/hobt/dic为活化氨基酸偶联形成fmoc-lys(fmoc)-rink amide mbha resin，nmp洗涤后加入25％pip/nmp脱除fmoc，得到h-lys(ε-nh2)-rink amide mbha resin,nmp洗涤残余哌啶，按照肽段序列偶联、洗涤、脱除fmoc及洗涤步骤，最终形成：

28、h-ala-arg(pbf)-leu-ala-ala-gln(trt)-leu-pro-ala-ser(tbu)-gly-ser(tbu)-ser(tbu)-lys(h-ala-arg(pbf)-leu-ala-ala-gln(trt)-leu-pro-ala-ser(tbu)-gly-ser(tbu)-ser(tbu)-)-rink amide mbha resin(保护肽树脂片段3)。

29、优选的，步骤5)具体为：在全保护的序列1肽树脂中加tfa/tis/dtt/h2o(90:5:2:3)脱除固相载体及氨基酸侧链保护基团，以叔丁基甲醚(mtbe)沉淀得到完整多肽(vyngtskysapatrrgdlgslaarlaaqlpasgss)2k的粗肽样品。

30、步骤5)中所述纯化为：将粗肽样品溶解于纯水中，经高压液相(hplc)-c18层析柱纯化得到最终纯度大于85％以上的完整序列1多肽。

31、作为一个实施方案，步骤s1中，序列2的合成包括如下步骤：

32、1)合成得到全保护肽段4：

33、fmoc-val-tyr(tbu)-ser(tbu)-gly-thr(tbu)-ser(tbu)-lys(boc)-tyr(tbu)-ser(tbu)-ala-pro-oh(保护肽片段4)；

34、2)合成保护肽段5：

35、fmoc-gln(trt)-asn(trt)-arg(pbf)-arg(pbf)-gly-asp(otbu)-ser(tbu)-gly-pro-leu-ala-oh(保护肽片段5)；

36、3)合成保护肽树脂片段3：

37、h-ala-arg(pbf)-leu-ala-ala-gln(trt)-leu-pro-ala-ser(tbu)-gly-ser(tbu)-ser(tbu)-lys(h-ala-arg(pbf)-leu-ala-ala-gln(trt)-leu-pro-ala-ser(tbu)-gly-ser(tbu)-ser(tbu)-)-rink amide mbha resin(保护肽树脂片段3)；

38、4)在保护肽树脂片段3的nmp溶液中，加入保护片段5/hoat/dic的活化片段进行偶联反应，反应完全后(kaiser test阴性),以哌啶脱除肽树脂上的fmoc，nmp洗涤后再加入保护片段4/tbtu/dipea的活化片段进行偶联反应，反应完全后(kaiser test阴性),以哌啶脱除肽树脂上的fmoc，得到全保护的序列2肽树脂；

39、5)在序列2肽树脂中脱除固相载体及氨基酸侧链保护基团，沉淀得到完整(vysgtskysapqnrrgdsgplaarlaaqlpasgss)2k的粗肽样品；纯化得到序列2多肽。

40、步骤1)具体为先合成肽树脂：

41、fmoc-val-tyr(tbu)-ser(tbu)-gly-thr(tbu)-ser(tbu)-lys(boc)-tyr(tbu)-ser(tbu)-ala-pro-2-chlorotrityl resin；去除固相载体，得到全保护肽段1。

42、所述合成肽树脂具体为：以2-chlorotrityl resin为固相载体，二异丙基乙基胺(dipea)为催化剂，将fmoc-pro-oh连接上树脂形成fmoc-pro-2-chlorotrityl resin，洗涤、脱除fmoc形成h-pro-2-chlorotrityl resin；加入fmoc-ala-oh/hbtu/dipea活化氨基酸偶联形成fmoc-ala-pro-2-chlorotrityl resin，洗涤、脱除fmoc，循环偶联、洗涤、脱除fmoc及洗涤、脱除fmoc步骤，依次偶联fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-val-oh，最终形成fmoc-val-tyr(tbu)-ser(tbu)-gly-thr(tbu)-ser(tbu)-lys(boc)-tyr(tbu)-ser(tbu)-ala-pro-2-chlorotrityl resin。

43、所述肽树脂以1％三氟乙酸(tfa)/二氯甲烷(dcm)处理去除固相载体，得到所述全保护肽段4。

44、优选的，步骤3)具体为：以rink amide mbha resin为固相载体，加入fmoc-lys(fmoc)-oh/hoat/edc.hcl为活化氨基酸偶联形成fmoc-lys(fmoc)-rink amide mbharesin，nmp洗涤后加入25％pip/nmp脱除fmoc，得到h-lys(ε-nh2)-rink amide mbharesin,nmp洗涤残余哌啶，按照肽段序列偶联、洗涤、脱除fmoc及洗涤步骤，最终形成所述保护肽树脂片段3。

45、优选的，步骤5)中，所述纯化为：将粗肽样品溶解于纯水中，经高压液相(hplc)-c18层析柱纯化得到最终纯度大于85％以上的完整序列2多肽。

46、优选的，步骤5)中，在序列2肽树脂中加tfa/tis/edt/h2o(90:5:3:2)脱除固相载体及氨基酸侧链保护基团，以叔丁基甲醚(mtbe)沉淀得到完整(vysgtskysapqnrrgdsgplaarlaaqlpasgss)2k的粗肽样品。

47、作为一个实施方案，步骤s1中，序列3的合成包括如下步骤：

48、1)合成全保护肽段6：

49、fmoc-val-tyr(tbu)-asn(trt)-gly-thr(tbu)-thr(tbu)-lys(boc)-tyr(tbu)-ser(tbu)-thr(tbu)-gly-oh(保护肽片段6)；

50、2)合成保护肽段7：

51、fmoc-asn(trt)-ala-gly-arg(pbf)-arg(pbf)-gly-asp(otbu)-leu-gly-ser(tbu)-leu-ala-oh(保护肽片段7)；

52、3)合成保护肽树脂片段8：

53、h-ala-arg(pbf)-val-ala-ala-gln(trt)-leu-pro-ala-ser(tbu)-gly-ser(tbu)-ser(tbu)-ly s(h-ala-arg(pbf)-val-ala-ala-gln(trt)-leu-pro-ala-ser(tbu)-gly-ser(tbu)-ser(tbu)-)-rink amide mbha resin(保护肽树脂片段8)；

54、4)在保护肽树脂片段8的nmp溶液中，加入保护片段7/hobt/dic的活化片段进行偶联反应，反应完全后(kaiser test阴性),以哌啶脱除肽树脂上的fmoc，nmp洗涤后再加入保护片段6/hatu/dipea的活化片段进行偶联反应，反应完全后(kaiser test阴性),以哌啶脱除肽树脂上的fmoc，得到全保护的序列3肽树脂；

55、5)在所述序列3肽树脂中脱除固相载体及氨基酸侧链保护基团，沉淀得到完整(vyngttkystgnagrrgdlgslaarvaaqlpasgss)2k的粗肽样品；纯化得到序列3多肽。

56、步骤1)中，先合成肽树脂：

57、fmoc-val-tyr(tbu)-asn(trt)-gly-thr(tbu)-thr(tbu)-lys(boc)-tyr(tbu)-ser(tbu)-thr(tbu)-gly-2-chlorotrityl resin；去除固相载体，得到所述全保护肽段6。

58、所述合成肽树脂具体为：

59、以2-chlorotrityl resin为固相载体，二异丙基乙基胺(dipea)为催化剂，将fmoc-gly-oh连接上树脂形成fmoc-gly-2-chlorotrityl resin，再以25％哌啶(pip)/nmp脱除fmoc形成h-gly-2-chlorotrityl resin，nmp洗涤去除残余哌啶后，加入fmoc-thr(tbu)-oh/pybop/dipea活化氨基酸偶联形成fmoc-thr(tbu)-gly-2-chlorotrityl resin，nmp洗涤残余氨基酸后再脱除fmoc，循环偶联、洗涤、脱除fmoc及洗涤步骤，依次偶联fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-val-oh，最终形成fmoc-val-tyr(tbu)-asn(trt)-gly-thr(tbu)-thr(tbu)-lys(boc)-tyr(tbu)-ser(tbu)-thr(tbu)-gly-2-chlorotrityl resin。

60、所述肽树脂以三氟乙醇(tfe)/乙酸/二氯甲烷(dcm)(1:1:8)处理去除固相载体，得到所述全保护肽段6。

61、优选的，步骤3)具体为：以rink amide mbha resin为固相载体，加入fmoc-lys(fmoc)-oh/hobt/dic为活化氨基酸偶联形成fmoc-lys(fmoc)-rink amide mbha resin，nmp洗涤后加入25％pip/nmp脱除fmoc，得到h-lys(ε-nh2)-rink amide mbha resin,nmp洗涤残余哌啶，按照肽段序列偶联、洗涤、脱除fmoc及洗涤步骤，最终形成所述保护肽树脂片段8。

62、优选的，步骤5)具体为：在全保护的序列3肽树脂中加tfa/tis/dtt/h2o(90:5:4:1)脱除固相载体及氨基酸侧链保护基团，以叔丁基甲醚(mtbe)沉淀得到完整(vyngttkystgnagrrgdlgslaarvaaqlpasgss)2k的粗肽样品。

63、优选的，步骤5)中，所述纯化为将所述粗肽样品溶解于纯水中，经高压液相(hplc)-c18层析柱纯化得到最终纯度大于85％以上的完整序列3多肽。

64、作为一个实施方案，步骤s2中，序列1、序列2、序列3的表位多肽的混合质量比为1:1:1～1:3:3，或为1:1:1～3:1:3，或为1:1:1～3:3:1。优选3种表位多肽等量混合。

65、作为一个实施方案，步骤s2中，所述包被是在2～8℃下包被18～24小时。

66、作为一个实施方案，步骤s2中，所述包被液为0.1mol/l、ph值9.55～9.65的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液，所述碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液含0.02％-0.08％dmso和0.3％-1％tween20。

67、本发明还提供一种口蹄疫病毒a型elisa抗体检测试剂盒，所述试剂盒包含前述的抗原包被板。

68、作为一个实施方案，所述试剂盒还包括酶结合物、酶结合物稀释液、样品稀释液、显色液、终止液、25倍洗涤液。

69、本发明还提供一种前述抗原包被板在制备口蹄疫病毒a型elisa抗体检测试剂盒中的用途。所述试剂盒用于检测口蹄疫a型抗体水平。进一步的，所述试剂盒用于检测口蹄疫a型病毒及疫苗作用后的动物血清中的a型抗体。在一些实施例中，所述试剂盒用于检测口蹄疫a型疫苗与o型疫苗多价使用后的动物血清中的a型抗体。

70、我国长期流行的口蹄疫病毒为o型，且危害最为严重，其中优势流行毒株是sea拓扑型mya-98毒株。2009年以来a型口蹄疫病毒开始在我国流行暴发，代表毒株包括a/sea-97g1分支毒的a/hubwh/cha/2009株和a/sea-97 g2分支毒的a/gdmm13/cha/2013株，此时可同时防控a型和o型病毒的口蹄疫oa二价灭活疫苗和合成肽疫苗在疫情防控中发挥了关键作用，包括申联生物医药(上海)股份有限公司兰州分公司等的猪口蹄疫o型，a型二价灭活疫苗(re/o/mya98/jscz/2013株+re-a/wh/09株)、猪口蹄疫o型，a型二价合成肽疫苗(多肽2700+2800+mm13)等。其中灭活疫苗的抗原为人工培养的、经化学灭活的病毒，而合成肽疫苗的抗原包含有o型mya-98毒株等代表毒株和a型a/gdmm13/cha/2013株的关键中和表位gh环序列，该疫苗可产生极高浓度针对gh环的中和抗体，因此可同时高效预防o型和a型口蹄疫病毒感染。根据2022年国家动物疫病免疫技术指南规定，需采用gb/t 18935-2018《口蹄疫诊断技术》规定的方法进行口蹄疫疫苗抗体日常检测。其中使用灭活疫苗免疫的，采用液相阻断elisa、固相竞争elisa检测免疫抗体；使用合成肽疫苗免疫的，采用vp1结构蛋白elisa检测免疫抗体。但因o型病毒和a型病毒结构蛋白氨基酸序列相似度高达75％以上，而位于结构蛋白上的gh环的氨基酸序列也高度相似，尤其是n末端和c末端存在完全一致的序列，因此在极高浓度特异抗体存在时，避免非特异检出o型抗体成为a型vp1结构蛋白elisa抗体检测试剂盒开发最主要难点。

71、设计多肽作为抗原进行elisa抗体检测，可能有效降低非特异性反应，但是多肽抗原直接应用于elisa抗体检测的难点在于，多肽上各氨基酸残基易以各种不可预测的作用力随机结合到96孔酶联反应板表面，包括亲水力、疏水力、范德华力或者离子键等，这导致多肽趴在板孔表面而不能在溶液中充分展示，不利于与抗体结合，导致诊断敏感性降低(如专利cn102998460b背景所述)。

72、多聚抗原肽通过在赖氨酸的α氨基和ε氨基上分别进行氨基和羧基缩合反应形成含多个多肽的树枝状肽分子，以期望达到展示多肽的目的。但随着所含多肽数目增多、多肽所含氨基酸残基数目增多，肽链之间以及肽链与基质树脂之间相互纠缠，将限制多肽与抗体之间的相互作用，因此目前所报道的用于诊断目的的多聚抗原肽所含氨基酸残基数目普遍不超过25个(根据文献doi 10.1007/s13337-013-0162-z)，用于诊断用途的超长多聚抗原肽(比如本发明中的多肽包含linker有35个氨基酸残基)的制备和应用是行业难点。

73、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

74、1)本发明通过确定口蹄疫a型病毒gh环表位多肽与口蹄疫o型合成肽疫苗抗体和口蹄疫o型灭活疫苗抗体非特异结合的序列，通过序列缩减有效解决非特异结合问题；但是缩减后的多肽(含32个氨基酸残基)对a型抗体的检测敏感性明显降低，进一步通过优化的固相合成法制备了超长多聚抗原肽(每分支肽含有35个氨基酸残基)，并通过优化多肽包被液的组分制备了包含该超长多聚抗原肽的抗原包被板，明显提高抗体检测敏感性，为首次成功制备超长多聚抗原肽和应用于抗体检测。

75、2)本发明最终确定多肽表位组合、含多肽表位组合的抗原包被板以及elisa抗体检测试剂盒；与商品化液相阻断试剂盒及竞争型试剂盒相比，本试剂盒对口蹄疫灭活疫苗免疫抗体和阴性血清检测总符合率较高达95％以上，但明显提高对口蹄疫合成肽疫苗免疫抗体的阳性检出率；

76、3)与商品化猪口蹄疫a型vp1结构蛋白elisa抗体检测试剂盒相比，本试剂盒可有效降低对口蹄疫病毒o型疫苗(猪口蹄疫o型合成肽疫苗(多肽2600+2700+2800)、猪口蹄疫病毒o型灭活疫苗(re-o/mya98/jscz/2013株))免疫抗体的交叉反应；

77、4)本发明的试剂盒有利于口蹄疫a型疫苗尤其a型合成肽疫苗免疫效果真实临床监测。