高效合成乳酰-N-四糖的工程大肠杆菌的构建方法及应用

本发明涉及高效合成乳酰-n-四糖的工程大肠杆菌的构建方法及应用，属于微生物代谢工程。

背景技术：

1、母乳寡糖(human milk oligosaccharides,hmos)作为母乳中除了乳糖和脂质外的第三大固体营养成分，它们为婴幼儿健康成长提供了不可替代的益处。相关研究表明母乳寡糖在肠道健康如抗菌作用、肠道屏障等方面发挥了独特作用。

2、目前，乳酰-n-四糖的合成方法分为化学合成法、酶法合成法和细胞工厂法。化学合成因其过程复杂且有毒性，无法进一步大规模生产乳酰-n-四糖。酶法合成需要昂贵的核苷酸糖底物和辅因子的加入，限制了其工业化生产乳酰-n-四糖。细胞工厂法生产乳酰-n-四糖的生物合成途径涉及两个关键基因，即编码β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶的基因来源于脑膜炎奈瑟菌(neisseria meningitidis)和编码β-1,3-半乳糖基转移酶的基因来源于大肠杆菌o55:7或者p.ferrooxidans。等人在大肠杆菌w3110基因组整合编码β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶的基因(lgta)和编码β-1,3-半乳糖基转移酶的基因(wbgo)，并优化培养基条件，强化udp-半乳糖的供应，最后在分批补料过程中，乳酰-n-四糖的产量为12.72g/l。zhu等人挖掘到新型的来源于p.ferrooxidans菌中编码β-1,3-半乳糖基转移酶的基因，实现了乳酰-n-四糖的高效生物合成，其产量达到25.49g/l。li等人通过途径优化和辅因子再生工程，有效提升了乳酰-n-四糖的生物合成途径，其摇瓶产量达到6.16g/l，在5l发酵罐分批补料过程中，乳酰-n-四糖的产量达到了57.5g/l。目前，乳酰-n-四糖的生产过程中，涉及到两个不同的前体和多基因的调控，质粒系统能有效调节菌体内代谢通路的变化，但是质粒系统需要抗生素的维持，并且稳定性较差，存在丢失情况。因此，工程大肠杆菌基因组的多位点的基因整合是最有效的解决办法之一，保证菌株传代的稳定性。

技术实现思路

1、为了减少质粒系统的利用，本发明利用crispr相关的转座酶系统将编码β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶的基因lgta进行基因组多拷贝的整合，从而构建了不同拷贝数lgta基因的工程大肠杆菌。再引入编码β-1,3-半乳糖基转移酶，构建完整的乳酰-n-四糖的生物合成途径，从而实现了乳酰-n-四糖(工程大肠杆菌生物合成乳酰-n-四糖代谢通路如图1所示)的高效稳定合成。

2、本发明提供了一种制备乳酰-n-三糖ii的大肠杆菌基因工程菌，所述基因工程菌为，，敲除大肠杆菌基因组上的β-半乳糖苷酶lacz、二磷酸尿核苷葡萄糖脱氢酶ugd、udp-n-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶wecb以及葡萄糖胺-6磷酸脱氨酶nagb；并在大肠杆菌的基因组上的reca位点整合来源于大肠杆菌k-12衍生菌mg1655的udp-葡萄糖4差向异构酶基因gale，同时在大肠杆菌的基因组上的is186位点整合了来源于脑膜炎奈瑟菌的编码β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶的基因lgta。

3、在本发明的一种实施方式中，所述β-半乳糖苷酶lacz在ncbi序列号为np_414878.1，二磷酸尿核苷葡萄糖脱氢酶ugd在ncbi序列号为act43781.1、udp-n-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶wecb在ncbi序列号为yp_026253.1，葡萄糖胺-6磷酸脱氨酶nagb在ncbi序列号为np_415204.1；所述编码β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶的基因lgta核苷酸序列如seqidno.1所示；所述udp-葡萄糖4差向异构酶基因gale核苷酸序列如seq id no.3所示。

4、在本发明的一种实施方式中，所述编码β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶的基因lgta在大肠杆菌基因组上整合的拷贝数分为单拷贝，双拷贝，三拷贝，四拷贝和五拷贝。

5、在本发明的一种实施方式中，所述reca位点为：ncbi号为：np_417179.1。

6、在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌为，大肠杆菌bl21(de3)敲除wecb，nagb，lacz，ugd，在大肠杆菌基因组上的reca位点整合基因gale，在大肠杆菌基因组上的is186-4位点(ncbi序列号为：gene id:8180040)整合基因lgta。

7、在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌为，大肠杆菌bl21(de3)敲除wecb，nagb，lacz，ugd，在大肠杆菌基因组上的reca位点整合基因gale，分别在大肠杆菌基因组上的is186-2位点(ncbi序列号为：gene id:8180306)和is186-4位点(ncbi序列号为：geneid:8180040)整合基因lgta。

8、在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌为，大肠杆菌bl21(de3)敲除wecb，nagb，lacz，ugd，在大肠杆菌基因组上的reca位点整合基因gale，分别在大肠杆菌基因组上的is186-2位点(ncbi序列号为：gene id:8180306)、is186-4位点(ncbi序列号为：gene id:8180040)和is186-5位点(ncbi序列号为：gene id:8183431)整合基因lgta。

9、在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌为，大肠杆菌bl21(de3)敲除wecb，nagb，lacz，ugd，在大肠杆菌基因组上的reca位点整合基因gale，分别在大肠杆菌基因组上的is186-1位点(ncbi序列号为：gene id:8180773)，is186-2位点(ncbi序列号为：gene id:8180306)，is186-3位点(ncbi序列号为：gene id:8181786)和is186-4位点(ncbi序列号为：gene id:8180040)整合基因lgta。

10、在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌为，大肠杆菌bl21(de3)敲除wecb，nagb，lacz，ugd，在大肠杆菌基因组上的reca位点整合基因gale，分别在大肠杆菌基因组上的is186-1位点(ncbi序列号为：gene id:8180773)，is186-2位点(ncbi序列号为：gene id:8180306)，is186-4位点(ncbi序列号为：gene id:8180040)和is186-5位点(ncbi序列号为：gene id:8183431)整合基因lgta。

11、在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌为，大肠杆菌bl21(de3)敲除wecb，nagb，lacz，ugd，在大肠杆菌基因组上的reca位点整合基因gale，分别在大肠杆菌基因组上的is186-1位点(ncbi序列号为：gene id:8180773)，is186-2位点(ncbi序列号为：gene id:8180306)，is186-3位点(ncbi序列号为：gene id:8181786)，is186-4位点(ncbi序列号为：gene id:8180040)和is186-5位点(ncbi序列号为：gene id:8183431)整合基因lgta。

12、本发明提供了一种制备乳酰-n-四糖大肠杆菌基因工程菌，所述基因工程菌为，敲除大肠杆菌基因组上的β-半乳糖苷酶lacz、二磷酸尿核苷葡萄糖脱氢酶ugd、udp-n-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶wecb以及葡萄糖胺-6磷酸脱氨酶nagb；并在大肠杆菌的基因组上的reca位点整合来源于大肠杆菌k-12衍生菌mg1655的udp-葡萄糖4差向异构酶基因gale，同时在大肠杆菌的基因组上的is186位点整合了来源于脑膜炎奈瑟菌的编码β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶的基因lgta，并过表达了来源于大肠杆菌o55:h7的β-1,3-半乳糖基转移酶wbgo。

13、在本发明的一种实施方式中，其特征在于，所述β-半乳糖苷酶lacz在ncbi序列号为np_414878.1，二磷酸尿核苷葡萄糖脱氢酶ugd在ncbi序列号为act43781.1、udp-n-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶wecb在ncbi序列号为yp_026253.1，葡萄糖胺-6磷酸脱氨酶nagb在ncbi序列号为np_415204.1；所述编码β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶的基因lgta核苷酸序列如seq id no.1所示；所述udp-葡萄糖4差向异构酶基因gale核苷酸序列如seq id no.3所示，所述编码β-1,3-半乳糖基转移酶的基因wbgo核苷酸序列如seq id no.2所示。

14、在本发明的一种实施方式中，所述编码β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶的基因lgta在大肠杆菌基因组上整合的拷贝数分为单拷贝，双拷贝，三拷贝，四拷贝和五拷贝。

15、在本发明的一种实施方式中，采用pcdfduet-1质粒表达β-1,3-半乳糖基转移酶wbgo。

16、在本发明的一种实施方式中，所述编码β-1,3-半乳糖基转移酶的基因(wbgo)克隆至pcdfduet-1质粒载体多克隆位点上的ncoi位点和ecori位点之间。

17、在本发明的一种实施方式中，所述reca位点为：ncbi号为：np_417179.1

18、在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌为，大肠杆菌bl21(de3)敲除基因wecb，nagb，lacz，ugd，在大肠杆菌基因组上的reca位点整合基因gale，在大肠杆菌基因组上的is186-4位点(ncbi序列号为：gene id:8180040)整合基因lgta，采用pcdfduet-1质粒表达β-1,3-半乳糖基转移酶wbgo。

19、在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌为，大肠杆菌bl21(de3)敲除基因wecb，nagb，lacz，ugd，在大肠杆菌基因组上的reca位点整合基因gale，分别在大肠杆菌基因组上的is186-2位点(ncbi序列号为：gene id:8180306)和is186-4位点(ncbi序列号为：gene id:8180040)整合基因lgta，采用pcdfduet-1质粒表达β-1,3-半乳糖基转移酶wbgo。

20、在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌为，大肠杆菌bl21(de3)敲除基因wecb，nagb，lacz，ugd，在大肠杆菌基因组上的reca位点整合基因gale，分别在大肠杆菌基因组上的is186-2位点(ncbi序列号为：gene id:8180306)、is186-4位点(ncbi序列号为：geneid:8180040)和is186-5位点(ncbi序列号为：gene id:8183431)整合基因lgta，采用pcdfduet-1质粒表达β-1,3-半乳糖基转移酶wbgo。

21、在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌为，大肠杆菌bl21(de3)敲除基因wecb，nagb，lacz，ugd，在大肠杆菌基因组上的reca位点整合基因gale，分别在大肠杆菌基因组上的is186-1位点(ncbi序列号为：gene id:8180773)，is186-2位点(ncbi序列号为：geneid:8180306)，is186-3位点(ncbi序列号为：gene id:8181786)和is186-4位点(ncbi序列号为：gene id:8180040)整合基因lgta，采用pcdfduet-1质粒表达β-1,3-半乳糖基转移酶wbgo。

22、在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌为，大肠杆菌bl21(de3)敲除基因wecb，nagb，lacz，ugd，在大肠杆菌基因组上的reca位点整合基因gale，分别在大肠杆菌基因组上的is186-1位点(ncbi序列号为：gene id:8180773)，is186-2位点(ncbi序列号为：geneid:8180306)，is186-4位点(ncbi序列号为：gene id:8180040)和is186-5位点(ncbi序列号为：gene id:8183431)整合基因lgta，采用pcdfduet-1质粒表达β-1,3-半乳糖基转移酶wbgo。

23、在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌为，大肠杆菌bl21(de3)敲除基因wecb，nagb，lacz，ugd，在大肠杆菌基因组上的reca位点整合基因gale，分别在大肠杆菌基因组上的is186-1位点(ncbi序列号为：gene id:8180773)，is186-2位点(ncbi序列号为：geneid:8180306)，is186-3位点(ncbi序列号为：gene id:8181786)，is186-4位点(ncbi序列号为：gene id:8180040)和is186-5位点(ncbi序列号为：gene id:8183431)整合基因lgta，采用pcdfduet-1质粒表达β-1,3-半乳糖基转移酶wbgo。

24、本发明提供了一种制备乳酰-n-三糖ii的方法，所述方法为，是以甘油为碳源，以乳糖为底物，采用上述制备乳酰-n-三糖ii的大肠杆菌基因工程菌，生物合成乳酰-n-三糖ii。

25、在本发明的一种实施方式中，所述碳源甘油的添加量为：20-30g/l。

26、在本发明的一种实施方式中，所述底物乳糖的添加量为：5-10g/l。

27、在本发明的一种实施方式中，所述生物合成的条件为：摇床转速为200rpm，温度由37℃降低为25℃。。

28、本发明提供了一种制备乳酰-n-四糖的方法，所述方法为，是以甘油为碳源，以乳糖为底物，采用上述制备乳酰-n-四糖的大肠杆菌基因工程菌，生物合成乳酰-n-四糖。

29、在本发明的一种实施方式中，所述碳源甘油的添加量为：20-30g/l。

30、在本发明的一种实施方式中，所述底物乳糖的添加量为：5-10g/l。

31、在本发明的一种实施方式中，所述生物合成的条件为：摇床转速为200rpm，0.2mm的iptg诱导后，温度由37℃降低为25℃。

32、本发明还提供了采用上述制备乳酰-n-三糖ii的大肠杆菌基因工程菌在制备含有乳酰-n-三糖ii的产品中的应用。

33、本发明还提供了采用上述制备乳酰-n-四糖的大肠杆菌基因工程菌在制备含有乳酰-n-四糖的产品中的应用。

34、有益效果

35、本发明通过crispr相关的转座酶系统实现了大肠杆菌基因组上多拷贝的lgta基因整合，得到乳酰-n-三糖ii生产的底盘菌株，其摇瓶产量可达到6.93g/l，该菌株无需添加额外的诱导剂，降低了生产成本和操作流程，该底盘菌株有较好的遗传稳定性和工业应用前景。再进一步引入含有编码β-1,3-半乳糖基转移酶的基因wbgo的质粒表达系统，成功构建了多株生产乳酰-n-四糖的工程大肠杆菌，其摇瓶产量可达到6.07g/l，验证了该底盘菌株的扩展性，为进一步合成其他复杂母乳寡糖奠定了基础，具有良好的工业前景。