T细胞受体的制作方法

本发明涉及t细胞受体(tcr)，其结合衍生自黑素瘤相关抗原(mage)a4蛋白(氨基酸230-239)的hla-a*0201限制性的十肽gvydgrehtv。本发明的tcr显示了对于该mage表位的优异的特异性谱。

背景技术：

1、癌症睾丸抗原(cta)是由约140个基因编码的肿瘤相关抗原(taa)的亚类。这些抗原的表达限制于免疫豁免部位，如睾丸、胎盘和胎儿卵巢；它们通常不在其它组织中表达。已经在恶性肿瘤中观察到这些基因的表达。cta的免疫原性导致在许多实体瘤中靶向这些抗原的癌症疫苗的广泛开发。在这一大类taa中，黑素瘤相关抗原(mage)已成为癌症免疫疗法的有希望的候选物。

2、作为多基因家族的成员，已经报道了超过30种癌症睾丸(ct)基因，其被组织入染色体x上的基因簇(ct-x抗原)。ct基因簇位于xq24和xq28之间，并且包括基因家族如mage和ny-eso-1。i型mage基因簇是被最广泛表征的，包括mage-a、mage-b和mage-c家族。mage-a蛋白由12种不同的mage-a基因家族成员(mage-a1至mage-a12)编码，并由保守的165-171个氨基酸碱基定义，其被称为mage同源结构域(mhd)。mhd对应于所有mage-a家族成员共有氨基酸的唯一区域。

3、t细胞识别以及与细胞表面分子和肽的复合物相互作用，所述细胞表面分子称为人白细胞抗原(“hla”)，或主要组织相容性复合物(“mhc”)。肽衍生自较大的分子，其由还提呈hla/mhc分子的细胞加工。t细胞和hla/肽复合物的相互作用受到限制，需要t细胞对hla分子和肽的特定组合具有特异性。如果不存在特异性的t细胞，即使其伴侣复合体存在，也没有t细胞响应。类似地，如果不存在特异性复合物但存在t细胞，则没有响应。该机制参与免疫系统对感染、自身免疫疾病的响应以及对异常(如肿瘤)的响应。

4、一些mage基因家族蛋白(mage-a至mage-c家族)仅在生殖细胞和癌症中表达。其它(mage-d至mage-h)在正常组织中广泛表达。所有这些mage蛋白家族具有与其它mage蛋白的序列紧密匹配的同源区，并且包含在免疫识别中展示为hla/肽复合物的肽。因此，重要的是选择针对期望的mage肽/hla-a2抗原高度特异性的tcr临床候选物。

5、mage a4是mage a基因家族的cta成员。虽然认为它可能在胚胎发育中起作用，但功能未知。在肿瘤发病机理中，它似乎参与肿瘤转化或肿瘤进展的方面。mage a4涉及大量肿瘤，包括精原细胞瘤、先天性角化不良、黑素瘤、肝细胞癌、肾细胞癌、胰腺癌、肺癌、结直肠癌和乳癌。肽gvydgrehtv(seq id no：1)对应于已知的mage-a4蛋白的氨基酸残基数230-239。

6、mage b2是mage b基因家族的cta。mage b2在睾丸和胎盘中以及在不同组织学类型的肿瘤的显著部分中表达。肽gvydgeehsv(seq id no：2)显示与mage a4的交叉反应性，使得某些tcr能够结合展示两种肽的hla分子。

技术实现思路

1、我们开发了一种tcr，其与展示mage a4肽gvydgrehtv的hla分子结合，优于mageb2。在第一方面，本发明提供了一种t细胞受体(tcr)，其具有结合与hla-a*0201复合的gvydgrehtv(seq id no：1)的特性，当使用可溶形式的tcr在25℃和ph为7.1-7.5的表面等离子体共振测量时，具有约0.05μm至约20.0μm的解离常数，其中所述tcr包含tcrα链可变结构域和tcrβ链可变结构域，并且其中tcr可变结构域至少与gvydgrehtv(seq id no：1)的残基v2、y3和d4构成接触。

2、在实施方案中，根据本发明的tcr具有结合与hla-a*0201复合的gvydgeehsv(seqid no：2)的特性，使用可溶形式的tcr在25℃和ph为7.1至7.5的表面等离子体共振测量时，具有约20μm至约50μm的解离常数，其中所述tcr包含tcrα链可变结构域和tcrβ链可变结构域。在一些实施方案中，解离常数高于50微摩尔(microm)，如100μm、200μm、500μm或更高。

3、因此，根据本发明的tcr能够有效地结合展示gvydgrehtv的hla，但不能结合展示gvydgeehsv的hla。

4、在一些实施方案中，tcr的α链可变结构域包含与seq id no：3的氨基酸残基1-111的序列(α链)具有至少80％同一性的氨基酸序列，和/或β链可变结构域包含与seq id no：4的氨基酸残基1-111的序列(β链)具有至少80％同一性的氨基酸序列。

5、在另一方面，本发明提供了一种t细胞受体(tcr)，其具有结合与hla-a*0201复合的gvydgrehtv(seq id no：1)的特性，并且包含tcrα链可变结构域和tcrβ链可变结构域，

6、所述α链可变结构域包含与seq id no：3的氨基酸残基1-111的序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，和/或

7、所述β链可变结构域包含与seq id no：4的氨基酸残基1-111的序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。

8、gvydgrehtvhla-a2复合物提供了本发明的tcr可靶向的癌症标志物。本发明提供了这样的tcr，其用于将细胞毒性或免疫效应剂递送至癌细胞和/或用于过继治疗(adoptive therapy)用途的目的。

9、使用国际免疫遗传学(imgt)tcr命名法描述tcr，并且链接到tcr序列的imgt公共数据库。天然α-β异二聚体tcr具有α链和β链。广泛地，每条链包含可变区、连接区和恒定区，β链通常还在可变区和连接区之间含有短的多变区，但是该多变区通常被认为是连接区的一部分。每个可变区包含嵌入框架序列中的三个cdr(互补决定区)，一个是名为cdr3的高变区。有几种类型的α链可变(vα)区和几种类型的β链可变(vβ)区，其区别在于它们的框架、cdr1和cdr2序列以及部分限定的cdr3序列。在imgt命名法中，vα类型通过唯一的trav编号来指代。因此，“trav21”定义具有独特框架和cdr1和cdr2序列的tcr vα区，以及部分由tcr到tcr间保守的氨基酸序列限定的cdr3序列，但所述cdr3序列还包含tcr到tcr间变化的氨基酸序列。以相同的方式，“trbv5-1”定义具有独特框架和cdr1和cdr2序列的tcr vβ区，但仅部分限定cdr3序列。

10、类似地，tcr的连接区由独特的imgt traj和trbj命名法定义，而恒定区由imgttrac和trbc命名法定义。

11、β链多变区在imgt命名法中通过缩写trbd指代，并且如所提及的，串联的trbd/trbj区通常一起被认为是连接区。

12、αβtcr的α和β链一般被认为各自具有两个“结构域”，即可变结构域和恒定结构域。可变结构域由可变区和连接区的连接组成。在本说明书和权利要求书中，术语“tcrα可变结构域”因此是指trav和traj区的串联，术语tcrα恒定结构域指细胞外trac区或c-末端截短的trac序列。同样，术语“tcrβ可变结构域”是指trbv和trbd/trbj区的串联，术语tcrβ恒定结构域指细胞外trbc区或c末端截短的trbc序列。

13、由imgt命名法定义的独特序列是众所周知的，并且对于在tcr领域工作的人员是可得到的。例如，它们可以在imgt公共数据库中找到。“t cell receptor factsbook”，(2001)lefranc和lefranc，academic出版社，isbn 0-12-441352-8也公开了由imgt命名法定义的序列，但由于其公开日期和随后的时滞，其中的信息有时需要通过参考imgt数据库来确认。

14、根据本发明的一种tcr包含seq id no：3所示的α链细胞外结构域(trav10+trac)和seq id no：4所示的β链细胞外结构域(trbv24-1+trbc-2)。术语“亲本tcr”、“亲本mage-a4 tcr”在本文中同义使用，用以指包含分别为seq id no：3和seq id no：4的细胞外α和β链的该tcr。期望提供相对于亲本tcr而言突变或修饰的tcr，其与亲本tcr相比对肽-hla复合物具有更高的亲和力和/或更慢的解离速率。

15、为了提供了一种所述突变或修饰的tcr的结合谱可以与其进行比较的参照tcr，使用根据本发明的可溶的tcr是方便的，所述可溶的tcr具有seq id no：3中给出的亲本mage-a4 tcrα链的细胞外序列和seq id no：4中给出的亲本mage-a4 tcrβ链的细胞外序列。该tcr在本文中称为“参照tcr”或“参照mage-a4 tcr”。注意，seq id no：5包含seq id no：3的亲本α链细胞外序列，并且c162已经取代t162(即trac的t48)。同样，seq id no：6是seq idno：4的亲本β链细胞外序列，并且c169已经取代s169(即trbc2的s57)，a187已经取代c187并且d201已经取代n201。相对于亲本α和β链细胞外序列的这些半胱氨酸取代使得能够形成链间二硫键，其稳定重折叠的可溶tcr，即通过重折叠细胞外α和β链形成的tcr。使用稳定的二硫键连接的可溶tcr作为参照tcr使得能够更方便地评估结合亲和力和结合半衰期。本发明的tcr可以包含上述突变。

16、本发明的tcr可以是非天然存在的和/或纯化的和/或工程化的。相对于亲本tcr，本发明的tcr可以具有在α链可变结构域和/或β链可变结构域中存在的多于一个突变。“工程化tcr”和“突变tcr”在本文中同义使用，并且一般是指相对于亲本tcr，具有引入的一个或多个突变的tcr，尤其是在其α链可变结构域和/或β链可变结构域。这些突变可以改善针对与hla-a*020101复合的gvydgrehtv(seq id no：1)的结合亲和力。在某些实施方案中，在α链可变结构域中存在1、2、3、4、5、6、7或8个突变，例如4个或8个突变，和/或在β链可变结构域中1、2、3、4或5个突变，例如5个突变。在一些实施方案中，本发明的tcr的α链可变结构域可以包含这样的氨基酸序列，其与seq id no：3的氨基酸残基1-11的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。在一些实施方案中，本发明的tcr的β链可变结构域可以包含这样的氨基酸序列，其与seq id no：4的氨基酸残基1-111的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。

17、本发明的tcr的α链可变结构域可以具有以下突变：

18、m4 v或l

19、参考seq id no：3中所示的编号，和/或

20、β链可变结构域可以具有以下突变中的至少一种：

21、n10 e

22、参考seq id no：4中所示的编号。

23、本发明的tcr的α链可变结构域可以包含seq id no：3、seq id no：5或seq id no：7-8的氨基酸残基1-105的氨基酸序列，

24、或者包含氨基酸序列，其中其氨基酸残基1-27、34-47和54-90分别与seq idno：3、seq id no：5或seq id no：7-8的氨基酸残基1-27、34-47和54-90的序列具有至少90％或95％的同一性，以及其中氨基酸残基28-33、48-53和91-105分别与seq id no：3、seq idno：5或seq id no：7-8的氨基酸残基28-33、48-53和91-105的序列具有至少90％或95％的同一性。

25、在α链可变结构域中，序列为

26、(i)其氨基酸残基1-26可以具有(a)与seq id no：3的氨基酸残基1-26的序列至少90％的同一性，或(b)相对于(a)的序列，可以具有一个、两个或三个氨基酸残基的插入或缺失；

27、(ii)氨基酸残基28-33是vspfsn(seq id no：17)；

28、(iii)其氨基酸残基33-49可以具有(a)与seq id no：3的氨基酸残基34-47的序列至少90％的同一性，或(b)相对于(a)的序列，可具有一个、两个或三个氨基酸残基的插入或缺失；

29、(iv)氨基酸残基48-53可以是ltimtf(seq id no：18)或ltrmtf(seq id no：19)或ltivtf(seq id no：20)或ltiltf(seq id no：21)；

30、(v)其氨基酸残基55-89可具有与seq id no：3的氨基酸残基54-90的序列至少90％的同一性，或者可以相对于前者具有一个、两个或三个插入、缺失或取代；

31、(vi)氨基酸90-93可以是cvvsggtdswgklqf(seq id no：22)。

32、本发明的tcr的β链可变结构域可以包含seq id no：4、或seq id no：6或seq idno：9的氨基酸序列，

33、或者包含氨基酸序列，其中其氨基酸残基1-45、51-67、74-109分别与seq idno：4、或seq id no：9的氨基酸残基1-45、51-67、74-109的序列具有至少90％或95％的同一性，以及其中氨基酸残基46-50、68-73和109-123分别与seq id no：4、或seq id no：9的氨基酸残基46-50、68-73和109-123的序列具有至少90％或95％的同一性。

34、在β链可变结构域中，序列为

35、(i)其氨基酸残基1-45可具有(a)与seq id no：4的残基1-45的氨基酸序列至少90％的同一性，或(b)相对于(a)的序列，可具有一个、两个或三个氨基酸残基插入或缺失；

36、(ii)氨基酸残基46-50可以是kghdr(seq id no：23)；

37、(iii)其氨基酸残基51-67可具有(a)与seq id no：4的氨基酸残基51-67的序列至少90％的同一性，或(b)相对于(a)的序列，可具有一个、两个或三个氨基酸残基插入或缺失；

38、(iv)氨基酸残基68-73可以是svfdk(seq id no：24)；

39、(v)其氨基酸残基54-90可具有(a)与seq id no：4的氨基酸残基54-90的序列至少90％的同一性，或(b)相对于(a)的序列，可具有一个、两个或三个氨基酸残基的插入或缺失；

40、(vi)氨基酸109-123是catsgqgayneqff(seq id no：25)或catsgqgayreqff(seqid no：26)；

41、本发明的tcr可以具有α和β链可变结构域的以下组合之一：

42、表1

43、 α链seq id no β链seq id no 3 4 3 6 3 9 5 4 5 6 5 9 7 4 7 6 7 9 8 4 8 6 8 9

44、在本发明的范围内的是本文公开的本发明的任何tcr的表型沉默变体。如本文所用，术语“表型沉默变体”应理解为指除了上述那些之外还包含一个或多个另外的氨基酸改变的tcr，其中tcr具有与没有所述改变的相应tcr相似的表型。为了本技术的目的，tcr表型包含抗原结合特异性(kd和/或结合半衰期)和抗原特异性。当在相同条件下(例如在25℃和在相同的spr芯片上)测量时，表型沉默变体对gvydgrehtv(seq id no：1)hla-a*0201复合物所具有的kd和/或结合半衰期是不含所述改变的相应tcr所测量的kd和/或结合半衰期的10％以内。合适的条件在实施例3中进一步定义。抗原特异性以下进一步定义。如本领域技术人员已知的，可以产生与上文详述的那些tcr相比在恒定结构域和/或可变结构域中引入有改变的tcr，而不改变与gvydgrehtv(seq id no：1)hla-a*0201复合物的相互作用的亲和力。尤其是，这种沉默突变可以引入已知不直接参与抗原结合的序列部分内(例如在cdr外)。这些简单的(trivial)变体包括在本发明的范围内。已经进行了一个或多个保守取代的那些tcr也形成本发明的一部分。

45、可以使用任何合适的方法进行突变，包括但不限于基于聚合酶链反应(pcr)、基于限制性酶的克隆或不依赖连接的克隆(lic)规程的那些。这些方法在许多标准分子生物学文本中详述。关于聚合酶链反应(pcr)和基于限制酶的克隆的更多细节，参见sambrook&russell，(2001)molecular cloning-a laboratory manual(第三版)cshl出版社。关于不依赖连接的克隆(lic)规程的进一步信息可以在rashtchian，(1995)curr opinbiotechnol 6(1)：30-6中找到。

46、本发明的tcr具有结合mage-a4肽，gvydgrehtv(seq id no：1)hla-a2复合物的特性。已发现相对于其它不相关表位，本发明的tcr对那些mage表位是高度特异性的，因此尤其适合作为用于将治疗剂或可检测标记递送至展示那些表位的细胞和组织的靶向载体。在本发明tcr的上下文中特异性涉及它们识别肽gvydgrehtv阳性的hla-a*0201靶细胞的能力，同时具有最小的识别肽阴性的hla-a*0201靶细胞或者展示mage b2肽gvydgeehsv的hla细胞的能力。为了测试特异性，tcr可以是可溶形式和/或可以在t细胞的表面上表达。可以通过测量在tcr和靶细胞存在下的t细胞活化水平来确定识别。在这种情况下，肽阴性或mage b2靶细胞的最小识别被定义为：当在相同条件下测量时，t细胞活化水平小于肽阳性靶细胞存在下产生的t细胞活化水平的10％，优选小于5％，更优选小于1％。对于本发明的可溶的tcr，可以在治疗相关的tcr浓度确定特异性。治疗相关浓度可以定义为10-9m或更低的tcr浓度，和/或比相应ec 50值高达100倍、优选高达1000倍高的浓度。肽阳性细胞可通过肽脉冲(peptide-pulsing)获得，或更优选地，它们可以天然地提呈所述肽。优选地，肽阳性和肽阴性细胞都是人细胞。

47、已经发现本发明的某些tcr非常适合用于过继治疗。这样的tcr对于复合物可以具有小于200μm的kd，例如约0.05μm至约20μm或约100μm，和/或对于复合物具有约0.5秒至约12分钟的结合半衰期(t1/2)。在一些实施方案中，本发明的tcr对复合物可以具有约0.05μm至约20μm、约0.1μm至约5μm或约0.1μm至约2μm的kd。不希望受理论束缚，对于在过继细胞治疗中具有治疗用途的tcr，似乎存在最佳的亲和力窗口。天然存在的tcr识别来自肿瘤抗原的表位，其一般具有太低的亲和力(20μm至50μm)，并且非常高的亲和力tcr(在纳摩尔范围或更高)具有交叉反应性问题(robbins等人(2008)j.immunol.180 6116-6131；zhao等人(2007)j.immunol.179 5845-5854；scmid等人(2010)j.immunol 1844936-4946)。

48、本发明的tcr可以是αβ异二聚体或者可以是单链形式。单链形式包括vα-l-vβ、vβ-l-vα、vα-cα-l-vβ或vα-l-vβ-cβ类型的αβtcr多肽，其中vα和vβ分别是tcrα和tcrβ可变区，cα和cβ分别是tcrα和tcrβ恒定区，l是接头序列。为了用作将治疗剂递送到抗原提呈细胞的靶向剂，tcr可以是可溶形式(即不具有跨膜或细胞质结构域)。为了稳定性，可溶的αβ异二聚体tcr优选在各个恒定结构域的残基之间具有引入的二硫键，例如wo 03/020763中所述的。存在于本发明的αβ异二聚体中的一个或两个恒定结构域可以在c末端(cterminus)或c端(c termini)截短，例如高达15个、或高达10个或高达8个或更少的氨基酸。对于在过继治疗中使用，αβ异二聚体tcr可以例如以具有细胞质和跨膜结构域的全长链转染。用于过继治疗的tcr可含有对应于天然存在于各自α恒定结构域和β恒定结构域之间的二硫键，另外地或可替代地，可存在非天然二硫键。

49、对于本领域技术人员显而易见的是，可以在序列的c末端和/或n末端处提供截短序列，截短1、2、3、4、5或更多个残基，而实质上不影响tcr的结合表征。所有这些简单的变体都包括在本发明中。

50、本发明的α-β异二聚体tcr通常包含α链trac恒定结构域序列和β链trbc1或trbc2恒定结构域序列。α链和β链恒定结构域序列可以通过截短或取代来修饰，用以缺失trac外显子2的cys4和trbc1或trbc2外显子2的cys2之间的天然二硫键。α链和β链恒定结构域序列也可以通过半胱氨酸残基取代trac的thr 48和trbc1或trbc2的ser 57来修饰，所述半胱氨酸在tcr的α和β恒定结构域之间形成二硫键。

51、本发明的一些tcr对于gvydgrehtv-hla-a2复合物具有实质上高于参照mage-a4tcr的结合亲和力和/或结合半衰期。增加天然tcr的结合亲和力通常降低tcr对其肽-mhc配体的特异性，这在zhao yangbing等人，the journal of immunology，the americanassociation of immunologists，us，vol.179，no.9，2007年11月1日，5845-5854中证实。然而，衍生自亲本tcr的本发明的tcr保持对gvydgrehtv-hla-a2复合物特异性，尽管具有比亲本tcr实质上更高的结合亲和力。此外，与亲本tcr相比，它们对mage-a4的选择性显著高于mage-b2(例如至少10倍)。

52、使用本文实施例3的表面等离子体共振(biacore)方法可以确定结合亲和力(与平衡常数kd成反比)和结合半衰期(表示为t1/2)。测量可以在25℃和ph7.1至7.5使用可溶形式的tcr进行。应当理解，使tcr的亲和力加倍导致kd减半。t1/2通过ln2除以解离速率(koff)计算。因此，t1/2的加倍导致koff减半。通常针对tcr的可溶形式，即截短以去除疏水性跨膜结构域残基的那些形式，测量tcr的kd和koff值。因此，应当理解，如果tcr的可溶形式满足这样的要求，即其对gvydgrehtv-hla-a2复合物具有结合亲和力和/或结合半衰期，则给定的tcr满足该要求。优选地，使用相同的测定方案测量给定tcr的结合亲和力或结合半衰期数次，例如3次或更多次，并且取结果的平均值。参照mage-a4 tcr具有通过该方法测量的约65μm的kd，以及其koff约为0.73s-1，(即，t1/2约为0.95s)。

53、在另一方面，本发明提供了编码本发明的tcr的核酸。在一些实施方案中，核酸是cdna。在一些实施方案中，本发明提供了包含编码本发明的tcr的α链可变结构域的序列的核酸。在一些实施方案中，本发明提供了包含编码本发明tcr的β链可变结构域的序列的核酸。核酸可以是非天然存在的和/或纯化的和/或工程化的。

54、在另一方面，本发明提供了包含本发明的核酸的载体。优选地，载体是tcr表达载体。

55、本发明还提供了携带本发明载体、优选tcr表达载体的细胞。载体包含在单个开放阅读框中、或者在两个不同的开放阅读框中分别编码α链和β链的本发明核酸。另一方面提供了携带第一表达载体和第二表达载体的细胞，所述第一表达载体包含编码本发明tcr的α链的核酸，所述第二表达载体包含编码本发明tcr的β链的核酸。这样的细胞在过继治疗中是尤其有用的。本发明的细胞可以是分离的和/或重组的和/或非天然存在的和/或工程化的。

56、因为本发明的tcr在过继治疗中具有效用，本发明包括提呈本发明tcr的非天然存在和/或纯化和/或工程化的细胞，特别是t细胞。本发明还提供了提呈本发明tcr的扩充的t细胞群。存在一些适合于用编码本发明tcr的核酸(比如dna、cdna或rna)转染t细胞的方法(参见例如robbins等人，(2008)j immunol.180：6116-6131)。表达本发明tcr的t细胞将适合用于基于过继治疗的癌症治疗。如本领域技术人员已知的，存在一些可以进行过继治疗的合适的方法(参见例如rosenberg等人，(2008)nat rev cancer 8(4)：299-308)。

57、本发明的可溶的tcr可用于将可检测标记或治疗剂递送至抗原提呈细胞和含有抗原提呈细胞的组织。因此它们可以与可检测标记(用于诊断目的，其中tcr用于检测提呈gvydgrehtv-hla-a2复合物的细胞的存在)、与治疗剂、或与pk修饰部分(例如通过peg化)结合(共价或其它)。

58、用于诊断目的的可检测标记包括例如荧光标记、放射性标记、酶、核酸探针和造影剂。

59、可以与本发明的tcr结合的治疗剂包括免疫调节剂、放射性化合物、酶(例如穿孔素)或化疗剂(例如顺铂)。为了确保在期望的位置发挥毒性作用，毒素可以在脂质体内与tcr连接，使得化合物缓慢释放。这将防止在体内转运过程中的损伤作用，并确保毒素在tcr与相关抗原提呈细胞结合后具有最大作用。

60、其它合适的治疗剂包括：

61、·小分子细胞毒性剂，即分子量小于700道尔顿，具有杀死哺乳动物细胞能力的化合物。这种化合物还可以含有能够具有细胞毒性作用的有毒金属。此外，应当理解，这些小分子细胞毒性剂还包括前药，即在生理条件下衰减或转化以释放细胞毒性剂的化合物。这种试剂的实例包括顺铂、美登素衍生物、雷查霉素(rachelmycin)、卡里奇霉素(calicheamicin)、多西他赛(docetaxel)、依托泊苷、吉西他滨、异环磷酰胺、伊立替康、美法仑、米托蒽醌、sorfimer卟吩姆钠(sodiumphotofrin)ii、替莫唑胺、拓扑替康，葡萄糖醛酸三甲曲沙(trimetreate glucuronate)，澳瑞他汀e、长春新碱和多柔比星；

62、·肽细胞毒素，即具有杀死哺乳动物细胞能力的蛋白或其片段。例如，蓖麻毒素、白喉毒素、假单胞菌细菌外毒素a、dna酶(dnase)和rna酶(rnase)；

63、·放射性核素，即同时伴随着一种或多种α粒子或β粒子或γ射线的发射而衰减的元素的不稳定同位素。例如，碘131、铼186、铟111、钇90、铋210和铋213、锕225和砹213；螯合剂可以用于促进这些放射性核素与高亲和力tcr或其多聚体的结合；

64、·免疫刺激剂，即刺激免疫响应的免疫效应分子。例如，细胞因子比如il-2和ifn-γ；

65、·超抗原及其突变体；

66、·tcr-hla融合；

67、·趋化因子，比如il-8、血小板因子4、黑素瘤生长刺激蛋白等；

68、·抗体或其片段，包括抗t细胞或抗nk细胞决定簇抗体(例如抗cd3、抗cd28或抗cd16)；

69、·具有抗体样结合表征的替代蛋白支架；

70、·补体活化剂；

71、·异种蛋白结构域、同种异体蛋白结构域、病毒/细菌蛋白结构域、病毒/细菌肽。

72、一个优选的实施方案，提供了本发明的tcr，所述tcr与抗cd3抗体或所述抗cd3抗体的功能片段或变体结合(通常通过融合至α或β链的n或c末端)。适合用于本文所述的组合物和方法的抗体片段和变体/类似物包括微型抗体(minibodies)、fab片段、f(ab')2片段、dsfv和scfv片段、nanobodiestm(这些构建体，由ablynx(比利时)销售，包含衍生自骆驼科(例如骆驼或美洲驼)抗体的合成的单免疫球蛋白可变重链结构域)，和结构域抗体(domantis(比利时)，其包含亲和力成熟的单一免疫球蛋白可变重链结构域或免疫球蛋白可变轻链结构域)，或者替代蛋白支架，其显示抗体样结合表征，比如affibodies(affibody(瑞典)，其包含工程化的蛋白a支架)，或者anticalins(pieris(德国)，其包含工程化的anticalins)，这仅仅是列举的一小部分。

73、对于一些目的，本发明的tcr可以聚集成包含几种tcr的复合物以形成多价tcr复合物。有一些人类蛋白含有可用于产生多价tcr复合物的多聚化结构域。例如，已经用于产生scfv抗体片段的四聚体的p53的四聚化结构域，与单体scfv片段相比，其显示出增加的血清持续性和显著降低的解离速率。(willuda等人(2001)j.biol.chem.276(17)14385-14392)。血红蛋白也具有可能用于这种应用的四聚化结构域。与本发明的非多聚野生型或t细胞受体异二聚体相比，本发明的多价tcr复合物可以具有增强的对gvydgrehtv hla-a2复合物的结合能力。因此，本发明的tcr的多价复合物也包括在本发明内。根据本发明的这种多价tcr复合物尤其可用于跟踪或靶向在体外或体内提呈特定抗原的细胞，并且还可用作产生具有此类用途的其它多价tcr复合物的中间体。

74、如本领域众所周知的，tcr可以经历翻译后修饰。糖基化是一种这样的修饰，其包含寡糖部分与tcr链中限定的氨基酸的共价附着。例如，天冬酰胺残基或丝氨酸/苏氨酸残基是寡糖附着的公知位置。特定蛋白的糖基化状态取决于一些因素，包括蛋白序列、蛋白构象和某些酶的可用性。此外，糖基化状态(即寡糖类型、共价连接和附着的总数)可以影响蛋白功能。因此，当生产重组蛋白时，通常需要控制糖基化。已经使用控制的糖基化来改善基于抗体的治疗剂(jefferis r.，nat rev drug discov.2009mar；8(3)：226-34.)。对于本发明的可溶的tcr，可以通过例如在体内使用特定细胞系或通过体外化学修饰控制糖基化。这种修饰是期望的，因为糖基化可以改善药代动力学，降低免疫原性并更接近地模拟天然人蛋白(sinclair am和elliott s.，pharm sci.2005aug；94(8)：1626-35)。

75、为了施用至患者，本发明的tcr、核酸和/或细胞(通常与可检测标记或治疗剂结合)可以与药学上可接受的载体或赋形剂一起以药物组合物提供。根据本发明的治疗或成像tcr通常作为无菌药物组合物的一部分提供，其通常包括药学上可接受的载体。该药物组合物可以是任何合适的形式(取决于将其施用至患者所期望的方法)。其可以以单位剂型提供，一般在密闭容器中提供，并且可以作为试剂盒的一部分提供。这样的试剂盒通常(尽管不一定)包括使用说明书。其可以包括多个所述单位剂型。

76、药物组合物可适于通过任何合适的途径施用，优选肠胃外(包括皮下、肌内或优选静脉内)途径。这样的组合物可以通过药学领域中已知的任何方法制备，例如通过在无菌条件下将活性成分与载体或赋形剂混合。

77、本发明的物质的剂量可以在宽限度之间变化，这取决于待治疗的疾病或病症、待治疗个体的年龄和状况等，并且医生将最终确定要使用的合适剂量。

78、本发明的tcr、药物组合物、载体、核酸和细胞可以以实质上纯的形式提供，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％纯度。

79、本发明还提供：

80、·一种本发明的tcr、核酸或细胞，其用于药物，优选用于治疗癌症比如实体瘤(例如肺、肝和胃转移)和/或鳞状细胞癌的方法。

81、·本发明的tcr、核酸或细胞在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

82、·一种治疗患者中癌症的方法，包括向患者施用本发明的tcr、核酸或细胞。

83、本发明的每个方面的优选特征是对于其它方面中的每一个加以必要的修改。在本文提及的现有技术文件在法律允许的最大范围内并入。

84、在以下非限制性实施例中进一步描述本发明。

85、参考所附序列，其中：

86、seq id no：1是mage a4肽

87、seq id no：2是mage b2肽

88、seq id no：3是亲本mage-a4特异性tcr的α链的细胞外部分的氨基酸序列，seq idno：4显示亲本mage-a4特异性tcrβ链氨基酸序列的β链的细胞外部分的氨基酸序列。

89、seq id no：5显示天然lenti tcr(本文称为“参照tcr”)的α链的氨基酸序列。除了半胱氨酸取代t162(即trac恒定区的t48)之外，序列与亲本tcr的序列相同。seq id no：6是天然lenti tcr(本文称为“参照tcr”)的β链。除了半胱氨酸取代s169(即trbc2恒定区的s57)并且a187取代c187和d201取代n201外，序列与亲本tcr的序列相同。

90、seq id no：7和8显示可存在于本发明的tcr中的α链的序列。形成cdr区或cdr区主要部分的子序列用下划线表示。

91、seq id no：9显示可存在于本发明的tcr中的β链的序列。形成cdr区或cdr区主要部分的子序列加下划线。

92、seq id no：10-15显示了tcr a、b和c的可溶α和β链的序列。根据本发明，这些tcr中没有一种可以被开发成功能性tcr。