用于体内合成3’SL的新型唾液酸转移酶的制作方法

本发明涉及唾液酸化人乳寡糖(hmo)的生产，特别是3’-唾液酸基乳糖(3’sl)的生物合成生产，以及适用于所述生产的基因工程细胞。

背景技术：

1、设计和建造细菌细胞工厂以生产唾液酸化人乳寡糖(hmo)，特别是更复杂的唾液酸化人乳寡糖(hmo)，对于为未来更复杂的产物提供创新和可扩展的解决方案至关重要。

2、为此，合理的菌株工程原理通常应用于单个细菌细胞。这些原理通常指a)向宿主引入所需的生物合成通路，b)所需反应中作为供体所需的相关活性糖的细胞池的增加，c)通过天然乳糖渗透酶lacy增强乳糖输入和d)引入合适的糖基转移酶，以促进唾液酸化寡糖的生物合成生产(参见bych等人2019,current opinion in biotechnology 56:130–137)。

3、wo2007/101862公开了使用例如来自脑膜炎奈瑟菌(neisseria meningitidis)的α-2,3-唾液酸转移酶nst结合neubca基因的表达以生产cmp-neu5ac来生产唾液酸化hmo。

4、在wo2019/020707中提出了生产唾液酸化hmo的进一步尝试，其描述了能够在细胞中生产复杂唾液酸化hmo的许多唾液酸转移酶，其中假设3’sl可以作为次要的副产物生产。

5、schelch等人2020年《生物技术进展》(biotechnology advances)44，107613，是一篇关于细菌唾液酸转移酶性质的综述。表2总结了大肠杆菌(e.coli)中表达的细菌唾液酸转移酶，没有指示产生了什么唾液酸寡糖(如果有的话)。

6、唾液酸化hmo的生产可能会受到生产菌株中唾液酸转移酶的副活性的阻碍，这种副活性可能会影响细胞甚至在没有底物的情况下健壮生长的能力，这反过来反映为唾液酸化hmo产物的产率低。

7、总之，需要用于hmo生产的唾液酸转移酶，其能够实现唾液酸化产物的更高产量以及生产菌株的稳定生长，以获得可扩展用于唾液酸化hmo，特别是3’sl的工业生产的稳定的唾液酸化hmo生产平台。

技术实现思路

1、本发明涉及一种基因修饰细胞，其包含编码具有α-2,3-唾液酸转移酶活性的酶的重组核酸序列，能够以高产率生产唾液酸化hmo，特别是3’sl，同时保持生产菌株的大规模稳定生长。特别地，在产物形成期间，在更宽范围的生长速率上观察到稳定的生长，这反过来允许在发酵期间更快且更大的碳源供给变化。

2、具体地，本发明涉及一种基因修饰细胞，其过表达选自clari1、neigon、poral和pmn的α-2,3-唾液酸转移酶，其包含seq id no:1、2、3或4之一的氨基酸序列或与seq idno:1、2、3或4之一具有至少80％，例如至少85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成。优选地，当所选择的α-2,3-唾液酸转移酶在强且优选异源启动子的控制下表达时，基因修饰细胞表现出稳定的生长，以及高的产物产率，因此适合于唾液酸化hmo的大规模工业生产。由本发明的细胞产生的唾液酸化hmo通常选自3’sl、fsl、dslnt和lst-a。优选地，所生产的唾液酸化hmo是3’sl，特别是不存在其它hmo副产物的3’sl。

3、根据本发明的基因修饰细胞还可以包含启动子元件，该启动子元件控制编码具有α-2,3-唾液酸转移酶活性的酶的重组核酸的表达。唾液酸转移酶可以例如受选自pglpf、pglpa、pglpt、plac、pmglb及其变体的启动子的控制，该启动子的核酸序列分别选自seq idno 12-22或41-54。优选地，唾液酸转移酶受重组启动子的控制，其比天然大肠杆菌plac启动子更强。优选地，唾液酸转移酶受重组启动子的控制，该重组启动子选自seq id no 13、18、19、20、21、22、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50和51。

4、本发明还涉及一种核酸构建体，其包含编码具有α-2,3-唾液酸转移酶活性的酶的重组核酸序列，其中所述酶选自clari1、neigon、poral、pmn的唾液酸转移酶，该clari1包含seq id no:1的氨基酸序列或与seq id no:1具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％同一性的氨基酸序列或由其组成，该neigon包含seq id no:2的氨基酸序列或与seq id no:2具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％同一性的氨基酸序列或由其组成，该poral包含seq id no:3的氨基酸序列或与seq id no:3具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％同一性的氨基酸序列或由其组成，该pmn包含seq id no:4的氨基酸序列或与seq id no:4具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％同一性的氨基酸序列或由其组成，并且其中所述核酸序列受选自pglpf、pglpa、pglpt、plac、pglb及其变体的启动子序列的控制，该启动子具有根据seq idno 12-22或41-54的核酸序列。所述核酸构建体通常用于宿主细胞中以生产唾液酸化hmo，例如3’sl。

5、根据本发明的基因修饰细胞还可以包含编码mfs转运蛋白的核酸序列，该mfs转运蛋白能够将唾液酸化hmo输出到细胞外基质中。优选地，mfs转运蛋白是分别具有根据seqid no:38、39或40的氨基酸序列的nec、yberc或fred蛋白。

6、根据本发明的基因修饰细胞可以包含用于制备唾液酸糖核苷酸如cmp-neu5ac的生物合成通路。所述唾液酸糖核苷酸通路可由编码来自空肠弯曲杆菌(campylobacterjejuni)的neubca的核酸序列(seq id no:35)编码。编码neubca的核酸序列可以从携带neubca操纵子的高拷贝质粒编码。

7、根据本发明的基因修饰细胞可以是微生物，例如细菌或真菌，其中所述真菌可以选自酵母细胞，例如驹形氏酵母属(komagataella)、克鲁维酵母属(kluyveromyces)、耶鲁维亚酵母属(yarrowia)、毕赤酵母属(pichia)、酵母菌属(saccharomyces)、裂殖酵母属(schizosaccharomyces)或汉逊酵母属(hansenula)的酵母细胞，或选自曲霉属(aspargillus)、镰刀菌属(fusarium)或木霉菌属(thricoderma)的丝状真菌，并且所述细菌可以选自示例性的埃希氏杆菌属(escherichia sp.)、芽孢杆菌属(bacillus sp.)、乳酸杆菌属(lactobacillus sp.)和弯曲杆菌属(campylobacter sp.)。因此，根据本发明的基因修饰细胞可以是大肠杆菌。

8、本发明的基因修饰细胞可用于以高产率生产唾液酸化hmo，特别是3’sl，同时保持稳定的生长。

9、因此，本发明还涉及一种生产唾液酸化人乳寡糖(hmo)，特别是3’-sl的方法，所述方法包括培养包含编码具有α-2,3-唾液酸转移酶活性的酶的重组核酸序列的基因修饰细胞，其中所述酶选自clari1、neigon、poral和pmn，其包含seq id no:1、2、3或4之一的氨基酸序列或与seq id no:1、2、3或4之一具有至少80％，例如至少85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方式中，所述基因修饰细胞包含根据本发明的至少一种额外的修饰。

10、下文将参考相关的附图和序列描述各种示例性实施方式和细节。应当注意，附图仅旨在促进实施方式的描述。它们不旨在作为对本发明的详尽描述或对本发明范围的限制。此外，所示实施方式不需要具有所示的所有方面或优点。结合特定实施方式描述的方面或优点不一定限于该实施方式，并且即使未如此示出或未如此明确描述，也可以在任何其它实施方式中实践。