利用LAMP技术快速检测瓜笄霉的引物组合物及其检测方法

本发明属于生物检测领域，涉及一种利用lamp技术快速检测瓜笄霉的引物组合物及其检测方法。

背景技术：

1、瓜笄霉(choanephora cucurbitarum)属于毛霉门(mucoromycota)，毛霉纲(mucoromycetes)，毛霉目(mucorales)，瓜笄霉科(choanephoraceae)，瓜笄霉属(choanephora)。choanephora cucurbitarum是一种重要的植物病原菌，能侵染瓜类、秋葵、辣椒、冰叶日中花、薄壳山核桃、油菜、西西兰花等多种植物，寄主范围广泛，引起植株湿腐、果腐、花腐、芽枯、叶斑等症状，在受侵染植物生产中造成较重的经济损失。choanephoracucurbitarum侵染植物体的速度非常快，在温湿度较适宜的情况下，两到三天即可表现症状。

2、目前对该病害还没有有效的防治措施，加强检疫、防止病原菌的传播扩散是控制该病的最有效措施。为此应加强监测，建立快速检测方法，为病害的风险及研究决策提供依据，从而有利于降低choanephora cucurbitarum引起的损失。

3、目前，针对choanephora cucurbitarum的检测技术较少。传统的检测方法主要是应用平板分离法，依据choanephora cucurbitarum的形态学进行鉴定。该方法耗时耗力，需要丰富和专业的病原菌鉴定经验，而且很难依据形态学特征将choanephora cucurbitarum与相近种区分开，无法满足田间生产上的需求。随着分子生物学的发展，特别pcr技术的普及，越来越多的分子生物学技术被应用到choanephora cucurbitarum的检测中。但是这些检测技术往往需要在具有专业仪器、试剂和严格环境条件的实验室中进行，仪器和试剂的价格昂贵且操作要求较高，过程复杂，检测时间仍然较长，不能满足快速检测的需求，不适宜在基层环境中使用推广。

4、环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，lamp)是一种基于pcr反应的分子检测技术，该技术应用bst大片段聚合酶，这种酶具有很强的链置换能力，不需要其它聚合酶的通常需要的模板变性的步骤，使反应能够在等温条件下进行。整个lamp反应过程在60～65℃进行，反应时间在80min内，简单的加热装置就可以满足反应，极大的降低了反应设备的复杂性与成本，这是lamp检测技术的一个突出的优点。与传统的pcr不同，lamp至少需要四对引物，与靶标dna序列的六个不同区域互补，lamp反应的最终产物是一系列含有多个靶标序列反向重复序列的茎环dna和花椰菜结构dna的混合物。lamp扩增产物可以利用羟基酚蓝(hnb)的变色与否指示反应结果的阳性或阴性，可通过肉眼观察颜色变化来判定。目前，lamp技术在等温条件下可以实现靶标dna特异、高效、快速的扩增，近些年来被广泛应用于医疗卫生、食品安全、海关检疫和农业生产等领域。目前此技术已广泛应用于真菌、细菌、病毒和卵菌的快速检测，但在choanephora cucurbitarum的检测国内外均未见报道。

5、靶标基因的选择是lamp检测的重要因素之一，目前lamp检测设计的引物的来源主要是转录间间隔区(its)，但是没有足够多的位点来区分相似种，因此开发出新的检测靶标成为检测的热点。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现有技术中瓜笄霉的生物学检测方法所需周期长、费时费力、繁琐、特异性差的问题及pcr检测技术需要热循环仪器，无法快速检测瓜笄霉的问题，而提供了一种快速检测瓜笄霉的lamp检测引物组合物及其分子检测方法，此方法检测周期短、准确性高、灵敏性高、肉眼观察检测结果。本发明以n-(5'-phosporibosyl)anthranilate isomerase(prai)基因为检测的靶标序列，设计了瓜笄霉的特异性的lamp引物组合物，在此基础上建立了瓜笄霉的lamp快速检测方法。

2、本发明的目的可通过如下技术方案实现：

3、特异性检测靶标prai在检测瓜笄霉中的应用，所述特异性检测靶标prai的核苷酸序列如seq id no.1所示。

4、ttcatcctgaaagtatcttgtgtgaaaatggacataccatgattcaaaactttttgaatttagaaggtggtacctgggaaggaaaccctggatctggtgttttgcctaaaaagttacgtcctactcctcctcctcctgctactgctgagcctactcaagaagccaatacaggtgctccctctatcttgactcgtatctatgctcaacgtgtgaaggatgttcaagctgcaaaagaaatagctggtcaaaccatggaagatttggaaaagcttttgcaacttcatgtagcacctccactccaagatgttgttgctcgtattagacatcagacacccgctcttttggctgaagtcaaacgtgcctctccatccaaaggtaacatcgatgtcactg(seq id no.1)。

5、检测瓜笄霉的lamp引物组合物，该引物组合物由以下引物组成:如seq id no.2所示的正向内引物fip，如seq id no.3所示的反向内引物bip，如seq id no.4所示的正向外引物f3，如seq id no.5所示的反向外引物b3，如seq id no.6所示的正向环引物lf，如seqid no.7所示的反向环引物lb。

6、本发明所述的引物组合物在制备瓜笄霉的lamp检测试剂盒中的应用。

7、一种检测瓜笄霉的lamp试剂盒，含有本发明所述的引物组合物。

8、所述的检测瓜笄霉的lamp试剂盒，还包含以下组分：10×thermo pol buffer，mgso4，dntps，甜菜碱，bstdnapolymerase，羟基萘酚蓝。

9、本发明所述的引物组合物或试剂盒在检测瓜笄霉的应用。

10、一种瓜笄霉的lamp检测方法，其特征在于，提取待检微生物dna，取dna溶液作为反应模板，加入所述lamp试剂盒中的检测溶液进行lamp反应，然后观察扩增产物的颜色变化，若呈天蓝色表示检测结果为阳性，存在瓜笄霉，若呈紫色表示检测结果为阴性，不存在瓜笄霉。

11、作为本发明的一种优选，所述的lamp反应体系：2.5μl 10×thermo pol buffer，8mmol·l-1mgso4，1.2mmol·l-1dntps，内引物fip和bip各1.6μmol·l-1，外引物f3和b3各0.4μmol·l-1，环引物lf和lb各0.8μmol·l-1，0.8μmol·l-1甜菜碱，8u·μl-1bstdnapolymerase，180mmol·l-1羟基萘酚蓝，2μl模板dna，体系共计26μl。

12、作为本发明的一种优选，所述lamp反应的程序为：63℃反应扩增62min。

13、本发明的检测瓜笄霉的方法，以提取的dna为模板，利用所述的lamp引物组合物进行lamp反应；hydroxylnaphtholblue(hnb)属于金属离子指示剂的一种。hnb是mg2+的滴定剂，其颜色随溶液ph变化而改变，因此可以通过监测lamp反应体系中mg2+浓度的变化及溶液ph而起到颜色指示剂的作用。反应前将hnb加入到反应液中，反应体系呈紫色，反应过程中mg2+与lamp反应的副产物结合产生大量沉淀，溶液中mg2+浓度降低，ph发生变化，从而使hnb的颜色由紫色变为天蓝色。因此，反应结束后通过反应体系的颜色变化，来判断瓜笄霉的有无：天蓝色表示检测为阳性，存在瓜笄霉；紫色表示检测结果为阴性，不存在瓜笄霉。

14、本发明与现有技术相比,本发明发现了新的靶标基因用于瓜笄霉的lamp检测，基于该基因，尤其是该基因上的特异靶区域，本发明设计了lamp引物组合物用于瓜笄霉的检测，具有特异性强、准确度高、灵敏度好的优点。

15、(1)实用性好。普通pcr反应对产物进行凝胶电泳很容易造成产物扩散,这是实验室污染的一个主要来源；而且溴化乙锭(eb)有巨毒，可累积致癌；长期观察紫外灯也会对实验人员造成一定程度的伤害。而lamp反应只需在恒温水浴锅中进行，反应结束之后通过观察溶液颜色的变化，判断是否有目标菌株的存在，提高其在田间的应用价值。

16、(2)恒温扩增。不像pcr法必须要热循环，这样就摆脱了对热循环仪器的依赖，只要有稳定的热源lamp反应就可以发生，极大的扩展了lamp使用的范围，lamp之所以能在恒定的热源下发生反应是因为在lamp反应液中添加了甜菜碱，使双链dna处于解链的动态平衡中，在bstdna聚合酶的作用下实现扩增。

17、(3)准确性高：而本发明根据瓜笄霉的prai基因(genbank登录号：mt555163)的序列，该序列在瓜笄霉中的基因组进化区和保守区轮流间隔。利用blast软件将瓜笄霉的基因组序列与其它真菌的基因组序列进行比较，选取了瓜笄霉特有的一端序列并设计特异性的lamp引物。lamp反应通过4条引物(fip、bip、f3、b3)特异性识别靶序列上的6个独立区域(表1)，其特异性比较高。此外，正向环引物lf和反向环引物lb能够提高反应速率，和其它四条引物一起，在确保反应准确性的情况下，使本发明能快速的进行瓜笄霉检测。lamp反应通过4条引物特异性识别靶序列上的6个独立区域，相对于pcr引物识别靶序列的2个独立区域而言，特异性和灵敏度都比较高。

18、(4)灵敏度高：本发明建立的瓜笄霉的lamp检测方法，灵敏度非常高，可以达到100pgdna，表明该检测方法足以在dna浓度较低情况下准确快速地检测出瓜笄霉。