聚合酶组合物和套组以及其使用与制造方法与流程

经修饰的dna聚合酶和组合物和套组，以及其使用和制造方法。

背景技术：

1、酶催化生物反应的能力对生命来说是基本的。一系列生物应用使用酶来活体外合成各种生物分子。一种尤其适用的类别的酶为聚合酶，其可催化生物分子(例如核苷酸或氨基酸)聚合成生物聚合物(例如核酸或肽)。举例来说，尤其以模板依赖性方式可将核苷酸聚合成核酸的聚合酶适用于重组dna技术和核酸测序应用中。许多核酸测序方法在由聚合酶催化的活体外模板依赖性核酸合成期间监测核苷酸掺入。单分子测序(sms)和双端测序(pes)典型地包括用于模板依赖性核酸合成的聚合酶。聚合酶也适用于产生核酸库，如在乳液pcr或桥式pcr期间产生的文库。使用此类聚合酶产生的核酸库可用于多种下游工艺中，如基因分型；核苷酸多态性(snp)分析；拷贝数变异分析；表观遗传分析；基因表达分析；杂交阵列；基因突变分析，包括(但不限于)疾病病况的检测、预后和/或诊断；罕见或低频等位基因突变的检测和分析；以及核酸测序，包括(但不限于)从头测序或目标重测序。

2、当进行聚合酶依赖性核酸合成或扩增时，其可适用于修饰聚合酶(例如经由突变或化学修饰)以改变其催化特性。在一些情况下，其可适用于修饰聚合酶以增强其催化特性。在一些实施例中，其可适用于经由定点氨基酸取代或缺失增强聚合酶的催化特性。可通过聚合酶对核苷酸底物的动力学行为来限制涉及核酸合成的各种生物分析中的聚合酶性能。举例来说，聚合酶活性分析可因以下非所需行为而变得复杂：如给定聚合酶从模板解离；结合和/或并入不正确(例如非沃森-克里克(watson-crick)碱基配对)的核苷酸；或释放正确(例如沃森-克里克碱基配对)的核苷酸而非并入的倾向。这些和其它所需特性可经由所选聚合酶的适合的选择、工程改造和/或修饰来增强。举例来说，可进行此类修饰以有利地改变聚合酶的核苷酸掺入比率、结合到模板的亲和力、持续合成能力、平均阅读长度、核苷酸掺入准确度、链偏差、系统误差和/或总测序通量；此类改变可提高序列信息量和/或获自单一测序反应的测序信息的质量。在所属领域中仍需要展现改变的特性，例如提高的持续合成能力、增加的阅读长度(包括无误差阅读长度)、提高的原始准确度和/或对dna模板的亲和力、增加的测序通量、减少的链偏差和/或减少的系统误差的改进的聚合酶组合物。此类聚合酶组合物可适用于广泛多种涉及聚合酶依赖性核酸合成的分析，包括核酸测序、qpcr、pcr、桥式pcr、等温扩增、克隆扩增以及核酸库产生。

技术实现思路

1、本发明大体上涉及非天然存在的突变(典型地重组)bst聚合酶和组合物、套组和其使用和制造方法。相比于参考(例如野生型)bst聚合酶，突变(例如重组)bst聚合酶含有至少一种氨基酸突变(例如取代、缺失或添加)且具有改良的特性。在一些实施例中，相比于野生型和/或参考突变bst dna聚合酶，突变(例如重组)bst dna聚合酶在合成测序反应，尤其在其中产生和/或检测氢离子的步骤中使用突变bst聚合酶的合成测序反应中具有减少的系统误差、提高的信噪比和/或改进的准确度。此外，本文提供用于进行聚合反应的方法，其包括在一种或多种核苷酸存在下使本文所提供的突变(例如重组)bst dna聚合酶或其生物活性片段与核酸模板接触，且使用突变聚合酶或其生物活性片段使一种或多种核苷酸中的至少一种聚合。

2、因此，在说明性实施例中，本发明提供典型地为重组dna聚合酶的非天然存在的突变dna聚合酶以及包括突变(例如重组)dna聚合酶的组合物、套组和方法，其中聚合酶具有与seq id no:1或其片段具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的多肽链段，展现聚合酶活性，且包括(a)一个或多个选自由以下组成的群组的氨基酸取代：e30k、g209q、e220h或e220t、n234k、p236i或p236r、e245r、l252r、s260k、d264k或d264m、e267m或e267k或e267r、e277t、t324r、e325r、a344y、e442r或e442y、e456r、h473g、d480l、n485r、a492k、e493g或e493r、m495c、n517c或n517k、e522c和h528t；或(b)两个或更多个选自以下的氨基酸取代：e30k、g209q、e220h、e220k或e220t、n234k或n234r、p236i或p236r、v241k、e245r、v251r、l252r、s260k、d264k或d264m、e267m或e267k或e267r、e277t、e294k、t324r、e325r、a344y、e442r或e442y、e456r、h473g、d480l或d480r、n485r、a492k、e493g或e493r、m495c、n517c或n517k、e522c和h528t。相比于使用参考bst聚合酶，如野生型bst聚合酶、seq id no:2的突变bst聚合酶或seq id no:35的突变bst聚合酶获得的误差率、准确度和/或信噪比，当在其中释放和/或检测氢离子的合成测序反应中使用时，突变(例如重组)dna聚合酶可导致降低的误差率(例如平均系统误差率)、改进的准确度和/或提高的信噪比。聚合酶在说明性实例中具有改进的特性的合成测序反应为释放和检测氢离子的测序反应。说明性实施例中的突变(例如重组)聚合酶包括氨基酸取代h46r、e446q和h572r，和/或可包括突变h281m、d423k和n487r，其中编号相对于seq id no:1。在说明性实施例中，突变(例如重组)聚合酶不具有5'到3'核酸外切酶活性和/或3'到5'核酸外切酶活性。在说明性实施例中，突变(例如重组)聚合酶不包含具有3'到5'核酸外切酶活性和/或5'到3'核酸外切酶活性的野生型bst dna聚合酶的链段。

3、说明性实施例中的突变(例如重组)dna聚合酶包括l252r、h473g和h528t中的一种或多种，其中编号相对于seq id no:1。因此，在本文所提供的某些实例中，突变(例如重组)dna聚合酶与seq id no:1或其片段具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的一致性，展现聚合酶活性，包括氨基酸取代h46r、e446q、h572r、h281m、d423k和n487r，且进一步包括l252r、h473g和h528t中的任何一种或两种，或包括l252r、h473g和h528t中的全部，其中编号相对于seq id no:1。在具有此类突变的示例性实施例中，非天然存在的突变异体具有seq id no:119序列。

4、在其它子实施例中，上文提供的实施例中的突变(例如重组)dna聚合酶的多肽链段可为突变(例如重组)dna聚合酶的至少50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，且可与seq id no:1具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性，或与seq id no:16(其为全长野生型bst聚合酶)具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。此类子实施例中的突变(例如重组)dna聚合酶展现聚合酶活性，可包括氨基酸取代h341r、e741q和h867r，和/或可包括突变h576m、d718k和n782r，且包括l547r、h768g和h823t中的一种或多种，其中编号相对于seqid no:16。在某些实施例中，突变(例如重组)dna聚合酶包括l547r、h768g和h823t。在具有此类突变的示例性实施例中，突变dna聚合酶具有seq id no:121的氨基酸序列。

5、在本发明的另一个方面中，提供一种用于进行聚合反应的方法，其包括以下：(a)在一种或多种核苷酸存在下使非天然存在的突变(例如重组)dna聚合酶与核酸接触；以及(b)使用突变(例如重组)dna聚合酶使一种或多种核苷酸中的至少一种聚合。此类方法中的突变(例如重组)dna聚合酶可包括与seq id no:1或其片段具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的多肽链段，展现聚合酶活性，可任选地包括h46r、e446q和h572r和/或h281m、d423k和n487r，且包括i)一个或多个选自由以下组成的群组的氨基酸取代：e30k、g209q、e220h或e220t、n234k、p236i或p236r、e245r、l252r、s260k、d264k或d264m、e267m或e267k或e267r、e277t、t324r、e325r、a344y、e442r或e442y、e456r、h473g、d480l、n485r、a492k、e493g或e493r、m495c、n517c或n517k、e522c和h528t，其中编号相对于seq id no:1；或ii)两个或更多个选自以下的氨基酸取代：e30k、g209q、e220h、e220k或e220t、n234k或n234r、p236i或p236r、v241k、e245r、v251r、l252r、s260k、d264k或d264m、e267m或e267k或e267r、e277t、e294k、t324r、e325r、a344y、e442r或e442y、e456r、h473g、d480l或d480r、n485r、a492k、e493g或e493r、m495c、n517c或n517k、e522c和h528t，其中编号相对于seq id no:1。在说明性实施例中，当在合成测序反应中使用时，相比于参考聚合酶，此类方法中使用的重组聚合酶可具有产生较低系统误差率、提高的信噪比和/或较高准确度的特性。说明性实例中的合成测序反应为产生且检测氢离子的反应。在说明性实施例中，方法中使用的突变(例如重组)聚合酶包括氨基酸取代h46r、e446q和h572r，和/或可包括突变h281m、d423k和n487r，其中编号相对于seq id no:1。盐可包括于反应混合物中，其中发生接触。反应混合物可例如以50到250mm，或100mm到200mm，或120到200mm，或超过120mm，如125mm到250mm，或125mm到175mm的浓度包括盐。说明性实例中的盐为kcl和/或nacl。

6、上文说明性实例中提供的用于进行聚合反应的方法中的突变(例如重组)dna聚合酶包括l252r、h473g和h528t中的一种或多种，其中编号相对于seq id no:1。因此，在本文所提供的某些说明性实例中，用于进行聚合反应的方法中使用的突变(例如重组)dna聚合酶与seq id no:1或其片段具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性，展现聚合酶活性，包括氨基酸取代h46r、e446q、h572r、h281m、d423k和n487r，且进一步包括l252r、h473g和h528t，其中编号相对于seq id no:1。在具有此类突变的示例性实施例中，非天然存在的突变(例如重组)dna聚合酶具有seq id no:119的序列。

7、在其它子实施例中，用于使上文所提供的实施例聚合的方法中的突变(例如重组)dna聚合酶的多肽链段可为突变(例如重组)dna聚合酶的至少50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，且可与seq id no:1或seq id no:16(其为全长野生型bst聚合酶)具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。用于聚合子实施例的此类方法中的突变(例如重组)dna聚合酶展现聚合酶活性，可包括氨基酸取代h341r、e741q和h867r，和/或可包括突变h576m、d718k和n782r，且包括l547r、h768g和h823t中的一种或多种，其中编号相对于seq id no:16。在某些说明性实施例中，突变(例如重组)dna聚合酶包括l547r、h768g和h823t。在说明性实施例中，突变(例如重组)聚合酶不具有5'到3'核酸外切酶活性和/或3'到5'核酸外切酶活性。在用于聚合实施例(其中突变(例如重组)dna聚合酶具有此类突变)的示例性方法中，突变dna聚合酶具有seq idno:121的氨基酸序列。

8、在本发明的另一个方面中，提供一种用于扩增核酸的方法，其包括以下：(a)在一种或多种核苷酸存在下使核酸与非天然存在的突变(例如重组)dna聚合酶接触，所述聚合酶包括与seq id no:1或其片段具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的多肽链段，展现聚合酶活性，可任选地包括h46r、e446q和h572r和/或h281m、d423k和n487r，且包括i)一个或多个选自由以下组成的群组的氨基酸取代：e30k、g209q、e220h或e220t、n234k、p236i或p236r、e245r、l252r、s260k、d264k或d264m、e267m或e267k或e267r、e277t、t324r、e325r、a344y、e442r或e442y、e456r、h473g、d480l、n485r、a492k、e493g或e493r、m495c、n517c或n517k、e522c和h528t，其中编号相对于seq id no:1；或ii)两个或更多个选自以下的氨基酸取代：e30k、g209q、e220h、e220k或e220t、n234k或n234r、p236i或p236r、v241k、e245r、v251r、l252r、s260k、d264k或d264m、e267m或e267k或e267r、e277t、e294k、t324r、e325r、a344y、e442r或e442y、e456r、h473g、d480l或d480r、n485r、a492k、e493g或e493r、m495c、n517c或n517k、e522c和h528t，其中编号相对于seq id no:1。在说明性实施例中，当在合成测序反应中使用时，相比于参考聚合酶，此类方法中使用的突变(例如重组)聚合酶具有产生较低系统误差率和/或较高准确度的特性。说明性实例中的合成测序反应为产生且检测氢离子的反应。说明性实例中的方法中使用的突变(例如重组)聚合酶包括氨基酸取代h46r、e446q和h572r，和/或可包括突变h281m、d423k和n487r，其中编号相对于seq id no:1。盐可包括于反应混合物中，其中发生接触。反应混合物可例如以50到250mm，或100mm到200mm，或120到200mm，或120到200mm，或超过120mm，如125mm到250mm，或125mm到175mm的浓度包括盐。说明性实例中的盐为kcl和/或nacl。

9、上文说明性实例中提供的用于扩增核酸的方法中的突变(例如重组)dna聚合酶包括l252r、h473g和h528t中的一种或多种，其中编号相对于seq id no:1。因此，在本文所提供的某些实例中，重组dna聚合酶和相关实施例中的突变dna聚合酶与seq id no:1或其片段具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性，展现聚合酶活性，包括氨基酸取代h46r、e446q、h572r、h281m、d423k和n487r，且进一步包括l252r、h473g和h528t，其中编号相对于seq id no:1。在具有此类突变的示例性实施例中，非天然存在的突变异体具有seq id no:119序列。

10、在其它子实施例中，上文所提供的用于扩增实施例的方法中的突变(例如重组)dna聚合酶的多肽链段可为突变(例如重组)dna聚合酶的至少50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，且可与seq id no:1或seq id no:16(其为全长野生型bst聚合酶)具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。此类子实施例中的突变(例如重组)dna聚合酶展现聚合酶活性，可包括氨基酸取代h341r、e741q和h867r，和/或可包括突变h576m、d718k和n782r，且包括l547r、h768g和h823t中的一种或多种，其中编号相对于seq id no:16。在某些实施例中，突变(例如重组)dna聚合酶包括l547r、h768g和h823t。在具有此类突变的示例性实施例中，突变dna聚合酶具有seq idno:121的氨基酸序列。

11、在某些实施例中，扩增方法为聚合酶链反应、乳液聚合酶链反应、等温扩增反应、重组酶聚合酶扩增反应、邻位连接扩增反应、滚环扩增反应或链置换扩增反应。在某些实施例中，扩增使核酸在溶液中或在固体载体上克隆扩增。

12、在本发明的另一个方面中，提供一种从核酸模板获得序列信息的方法，其包括以下：(a)提供包含模板核酸、测序引物、一种或多种核苷酸和非天然存在的突变(例如重组)dna聚合酶的反应混合物；(b)使模板核酸与至少一种类型的核苷酸接触，其中接触包括将来自至少一种类型的核苷酸的一种或多种核苷酸掺入于测序引物的3'端上且使用突变(例如重组)dna聚合酶产生延伸的引物产物；以及(c)检测反应混合物中延伸的引物产物的存在，由此判定是否已发生核苷酸掺入。此类方法中的突变(例如重组)dna聚合酶可包括与seq id no:1或其片段具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的多肽链段，展现聚合酶活性，可任选地包括h46r、e446q和h572r和/或h281m、d423k和n487r，且包括i)一个或多个选自由以下组成的群组的氨基酸取代：e30k、g209q、e220h或e220t、n234k、p236i或p236r、e245r、l252r、s260k、d264k或d264m、e267m或e267k或e267r、e277t、t324r、e325r、a344y、e442r或e442y、e456r、h473g、d480l、n485r、a492k、e493g或e493r、m495c、n517c或n517k、e522c和h528t，其中编号相对于seq id no:1；或ii)两个或更多个选自以下的氨基酸取代：e30k、g209q、e220h、e220k或e220t、n234k或n234r、p236i或p236r、v241k、e245r、v251r、l252r、s260k、d264k或d264m、e267m或e267k或e267r、e277t、e294k、t324r、e325r、a344y、e442r或e442y、e456r、h473g、d480l或d480r、n485r、a492k、e493g或e493r、m495c、n517c或n517k、e522c和h528t，其中编号相对于seq id no:1。在说明性实施例中，当在合成测序反应中使用时，相比于参考聚合酶，此类方法中使用的重组聚合酶可产生较低系统误差率和/或较高准确度。说明性实例中的合成测序反应为产生且检测氢离子的反应。反应混合物可例如以50到250mm，或100mm到200mm，或120到200mm，或超过120mm，如125mm到250mm，或125mm到175mm的浓度包括盐。说明性实例中的盐为kcl和/或nacl。

13、用于从上文说明性实例中提供的核酸模板获得序列信息的方法中的突变(例如重组)dna聚合酶包括l252r、h473g和h528t中的一种或多种，其中编号相对于seq id no:1。因此，在本文所提供的某些实例中，重组dna聚合酶和相关实施例中的突变dna聚合酶与seqid no:1或其片段具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性，展现聚合酶活性，包括氨基酸取代h46r、e446q、h572r、h281m、d423k和n487r，且进一步包括l252r、h473g和h528t，其中编号相对于seq id no:1。在用于获得序列信息的方法的示例性实施例中，具有此类突变的突变(例如重组)dna聚合酶具有seq id no:119的序列。

14、在用于从核酸模板获得序列信息的方法的其它子实施例中，上文所提供的实施例中的突变(例如重组)dna聚合酶的多肽链段可为突变(例如重组)dna聚合酶的至少50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，且可与seq id no:1或seq id no:16(其为全长野生型bst聚合酶)具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。此类子实施例中的突变(例如重组)dna聚合酶展现聚合酶活性，可包括氨基酸取代h341r、e741q和h867r，和/或可包括突变h576m、d718k和n782r，且包括l547r、h768g和h823t中的一种或多种，其中编号相对于seq id no:16。在某些实施例中，突变(例如重组)dna聚合酶包括l547r、h768g和h823t。在用于获得序列信息的方法的示例中，具有此类突变的突变(例如重组)dna聚合酶具有seq id no:121的氨基酸序列。

15、在方法的实施例中，掺入于测序引物的3'端上的一种或多种核苷酸中的至少一种为可逆终止子核苷酸；所述接触包括产生一个或多个氢离子作为核苷酸掺入的副产物；检测包括测量作为核苷酸掺入副产物产生的一个或多个氢离子的浓度；且所述方法进一步包括鉴别从至少一种类型的核苷酸掺入的一种或多种核苷酸中的至少一种。方法接触、检测和鉴别步骤重复超过一次，由此鉴别多次连续核苷酸掺入。