一种提高菌株冻干效果的冻干保护剂配方的制作方法

本发明属于微生物，具体为一种提高菌株冻干效果的冻干保护剂配方。

背景技术：

1、冻干技术在微生物领域主要有以下应用：微生物菌种的冻干保存是冻干技术在微生物领域的重要技术之一；冻干法是目前最常用的也是最有效的菌种保存方法，适用于绝大多数微生物菌种，保存期长，成活率高，目前已经是长期保存细菌，酵母等真菌的主要方式。

2、嗜黏蛋白阿克曼氏菌是一种人类肠道的正常菌，是一种粘蛋白分解细菌，菌株muct于2004年分离，为卵圆形，革兰阴性的厌氧菌，是疣微菌门的代表。该类菌株与肥胖、糖尿病、心血管疾病和低度炎症呈负相关。口服嗜粘蛋白阿克曼菌可改善小鼠代谢疾病的相关症状，嗜粘蛋白阿克曼菌有望成为治疗2型糖尿病和肥胖的候选药物。

3、该细菌与现有的革兰氏阴性菌不同的是其可以分解人类肠道黏蛋白，并且对动物蛋白有一定的分解作用，所以，现有的冻干保护剂不适合该细菌的冻干保护，并且使用现有的冻干保护剂不但降低该类冻干细菌的成活率，而且其生物活性也会明显降低。因为目前的冻干保护剂主要有脱脂乳、海藻糖、三聚磷酸钾和抗坏血酸作为保护剂，主要原因包括如下几点。脱脂乳不管单独使用还是与其他冻干保护剂混合使用均具有良好的保护作用，它在冻干过程中能使溶液呈过冷状态，抑制细胞内蛋白质的变性失活，维持细胞内稳态以降低细胞死亡率，另外，它含有大量的蛋白质，能够减少细胞暴露于氧气和介质中的表面积，给细胞提供了保护性的外衣，减少细胞壁损伤。海藻糖在冻干过程中能扩散至胞内并填充在胞内酶和其他蛋白质等活性大分子周围，当细胞失水时，海藻糖的羟基可与胞内的生物活性大分子的极性基团形成氢键，代替极性基团周围失去的水分子，从而维持细胞内蛋白质分子的稳定性。抗坏血酸的羟基能够与乳酸菌菌体细胞壁中磷脂分子的磷酸基团之间形成氢键，从而抑制细胞膜因失水而受损。三聚磷酸钾能够在胞内液中结合水分子，发生水合作用，使胞内液的粘性增加，从而在冻干过程中弱化了水的结晶过程，降低了体系中水转化成冰的比例，使其直接进入升华阶段。

4、申请人进行保藏的嗜黏蛋白阿克曼氏菌m1851，经过试验测定，采用现有的冻干保护剂进行冻干的嗜黏蛋白阿克曼氏菌m1851，其成活率不到28%，并且生物活性不到原来的1/10。另外冻干保护剂不仅要从细胞学角度对菌种的稳定性进行考虑，更要考虑到在冻干过程中外界因素对细胞的毒性侵害。为解决现有技术中存在的问题，申请人的研发人员对该问题进行了深入研究，研发出一种针对提高嗜黏蛋白阿克曼氏菌株冻干效果的冻干保护剂配方。

技术实现思路

1、本发明的目的在于解决上述背景技术中提出的至少问题之一，为此本发明提供一种提高菌株冻干效果的冻干保护剂配方，采用本发明的配方制备的冻干保护剂具有对嗜黏蛋白阿克曼氏菌具有高成活率，高活性的优点。

2、具体方案为：一种提高菌株冻干效果的冻干保护剂配方，包括豌豆蛋白粉15-20重量份、甜菜碱10-15重量份、分枝低聚糖3-8重量份、羟丙基甲基纤维素醚6-10重量份、硫胺素0.2-0.5重量份、vpp 0.05-0.1重量份、游离氨基酸6-10重量份、透明质酸12-18重量份。

3、丙基甲基纤维素醚的分子量小于240。

4、所述游离氨基酸为天然α—氨基酸。

5、所述豌豆蛋白粉经过如下处理，本发明还提供一种豌豆蛋白粉的处理工艺，具体为：

6、选普通的豌豆蛋白粉10-20g加入0.05-0.2mol/l、ph8-9的硼酸钠缓冲液200ml，缓慢搅拌，之后加入20-30g海藻糖，在3000-5000lex强度波长520-600nm紫外光下照射并同时搅拌30-50min，同时加温至50-60℃，进行接枝反应，得到的产物中含有海藻糖接枝的豌豆蛋白粉。反应完毕后，分三次加入去离子水进行透析清洗，每次600-800ml，洗掉小分子后将获得的产物进行干燥，得到含有部分海藻糖接枝的豌豆蛋白粉混合物复合物，即本技术方案中的处理后的豌豆蛋白粉。

7、所述甜菜碱为磷酸酯甜菜碱。

8、所述磷酸酯甜菜碱为十二烷基羟丙基磷酸酯甜菜碱和十四烷基羟丙基磷酸酯甜菜碱的任一种或两种混合。

9、所述硫胺素和vpp 的重量份数比为3:1-6:1。

10、本发明还提出一种冻干保护剂的制备方法：采用本发明冻干保护剂的配方，称取冻干保护剂重量份2-3倍的去离子水，将配方中的冻干保护剂加入去离子水中，搅拌均匀，然后杀菌处理，处理方式1为升温至95-103℃，保持温度30min，然后冷却至常温，得到冻干保护剂；处理方式2为紫外线杀菌处理。经过测试发现，优选处理方式2。

11、本发明还提出一种嗜黏蛋白阿克曼氏菌冻干剂的制备方法，所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌冻干粉包括嗜黏蛋白阿克曼氏菌的菌泥和本发明的冻干保护剂，制备温度和工艺参考现有菌株冻干粉的加工工艺。

12、本发明中涉及的菌株嗜黏蛋白阿克曼氏菌m1851，申请人于2022年3月14日将其保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：gdmcc no：62290，保藏单位名称为：广东省科学院微生物研究所，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，分类学名称为：akkermansia muciniphila。

13、与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

14、1、本发明处理后的豌豆蛋白粉可以稳定细胞膜成分，减少菌体细胞损伤又不会被分解，使冻干粉的组分一直处于平衡状态；甜菜碱具有极佳的吸水性能，其主要功能为保护蛋白分子不失水变性失活；分枝低聚糖在抑制其他细菌的同时可以促进嗜黏蛋白阿克曼氏菌菌体细胞繁殖，羟丙基甲基纤维素醚因具有较多的氢键、疏水键能够维持细胞膜上及细胞膜内蛋白质的三级结构稳定性，硫胺素和vpp混合主要功能为可以促进菌群生长，游离氨基酸能够维持菌体ph值相对稳定，防止菌体生物活力下降，透明质酸具有很好的保湿效果，和甜菜碱组合保护细菌细胞膜不失水的同时，还有效调节细胞内渗透压的平衡。

15、2、通过处理方式2得到的冻干保护剂效果更佳，发明人推测其原理为质酸、分枝低聚糖等小分子糖和豌豆蛋白粉在紫外光照作用下发生反应，部分糖类小分子接枝到蛋白上，得到了吸湿性能更佳的络合物，提高了对冻干菌株的保护效果。

技术特征：

1. 一种提高菌株冻干效果的冻干保护剂配方，其特征在于：包括豌豆蛋白粉15-20重量份、甜菜碱10-15重量份、分枝低聚糖3-8重量份、羟丙基甲基纤维素醚6-10重量份、硫胺素0.2-0.5重量份、vpp 0.05-0.1重量份、游离氨基酸6-10重量份、透明质酸12-18重量份。

2.根据权利要求1所述的一种提高菌株冻干效果的冻干保护剂配方，其特征在于：所述羟丙基甲基纤维素醚的分子量小于240。

3.根据权利要求2所述的一种提高菌株冻干效果的冻干保护剂配方，其特征在于：所述豌豆蛋白粉经过如下处理，具体为：选豌豆蛋白粉10-20g加入0.05-0.2mol/l、ph8-9的硼酸钠缓冲液200ml，缓慢搅拌，之后加入20-30g海藻糖，在3000-5000lex强度波长520-600nm紫外光下照射并同时搅拌30-50min，同时加温至50-60℃，进行接枝反应，得到的产物中含有海藻糖接枝的豌豆蛋白粉；反应完毕后，用去离子水进行透析清洗，将洗掉小分子后获得的产物进行干燥，得到含有部分海藻糖接枝的豌豆蛋白粉混合物复合物，即处理后的豌豆蛋白粉。

4.根据权利要求1所述的一种提高菌株冻干效果的冻干保护剂配方，其特征在于：所述甜菜碱为磷酸酯甜菜碱。

5.根据权利要求4所述的一种提高菌株冻干效果的冻干保护剂配方，其特征在于：所述磷酸酯甜菜碱为十二烷基羟丙基磷酸酯甜菜碱和十四烷基羟丙基磷酸酯甜菜碱的任一种或两种混合。

6.根据权利要求1所述的一种提高菌株冻干效果的冻干保护剂配方，其特征在于：所述硫胺素和vpp 的重量份数比为3:1-6:1。

7.一种提高菌株冻干效果的冻干保护剂的制备方法：其特征在于：采用权利要求1-6任一项所述的冻干保护剂的配方，称取冻干保护剂重量份2-3倍的去离子水，将配方中的冻干保护剂加入去离子水中，搅拌均匀，然后杀菌处理，得到提高菌株冻干效果的冻干保护剂。

8.根据权利要求7所述的一种提高菌株冻干效果的冻干保护剂的制备方法，其特征在于：杀菌处理的方式为升温至95-103℃，保持温度30min，然后冷却至常温，得到冻干保护剂。

9.根据权利要求7所述的一种提高菌株冻干效果的冻干保护剂的制备方法，其特征在于：杀菌处理的方式为紫外线杀菌处理。

10.一种嗜黏蛋白阿克曼氏菌冻干粉，其特征在于：嗜黏蛋白阿克曼氏菌冻干粉包括嗜黏蛋白阿克曼氏菌的菌泥和权利要求8-9任一项所述的提高菌株冻干效果的冻干保护剂。

技术总结
本发明公开了一种提高菌株冻干效果的冻干保护剂配方，包括豌豆蛋白粉15‑20重量份、甜菜碱10‑15重量份、分枝低聚糖3‑8重量份、羟丙基甲基纤维素醚6‑10重量份、硫胺素0.2‑0.5重量份、VPP 0.05‑0.1重量份、游离氨基酸6‑10重量份、透明质酸12‑18重量份。本发明处理后的豌豆蛋白粉可以稳定细胞膜成分，减少菌体细胞损伤又不会被分解，使冻干粉的组分一直处于平衡状态；甜菜碱具有极佳的吸水性能，其主要功能为保护蛋白分子不失水变性失活。

技术研发人员：徐晓强,王晓凯,陈练佳
受保护的技术使用者：深圳零一生命科技有限责任公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13