腺嘌呤脱氨酶及其在碱基编辑中的用途

本发明涉及基因工程领域。具体而言，本发明涉及腺嘌呤脱氨酶及其在碱基编辑中的用途。更具体而言，本发明涉及一种基于新鉴定的腺嘌呤脱氨酶的碱基编辑系统，使用该碱基编辑系统对生物体(例如植物)基因组中的靶序列进行碱基编辑的方法，以及通过所述方法产生的经遗传修饰的生物体(例如植物)及其后代。

背景技术：

0、发明背景

1、对生物体的基因组进行特定序列的修改，可以赋予生物体新的可稳定遗传的性状。其中，特定位点的单核苷酸的变异，有可能导致基因的氨基酸序列发生改变或提前终止，或者导致调控序列的改变，从而导致优良性状的产生。基因组编辑技术，例如crispr/cas9系统，可以实现对目标序列的靶向功能。利用基因组编辑系统与目标序列结合的特性，将其与脱氨酶进行结合所开发出的碱基编辑系统，可以实现精准地对基因组上的靶位点进行脱氨的功能。目前，最常用的量大碱基编辑系统包括胞嘧啶碱基编辑系统和腺嘌呤碱基编辑系统。其中，通过融合大肠杆菌tada(trna-specific adenosine deaminase)的变体，可以实现目标位点腺嘌呤(a)向次黄嘌呤(i)的转变。dna上的i可以被细胞识别为鸟嘌呤(g)，并且在复制过程中i会被g所替换。因此，目标位点的a可以最终实现向g进行转变。此外，通过在对侧未发生脱氨的单链引入缺刻使其断裂，可以显著提升碱基编辑的效率。由于自然界中不存在可以直接对dna的腺嘌呤(a)进行脱氨的腺嘌呤脱氨酶，目前可用于dna水平上的腺嘌呤脱氨酶的系统只有由david r.liu团队经过进化得到的一系列来源于大肠杆菌的ectada变体。因此，寻找新型的腺嘌呤脱氨酶，对于扩充现有的腺嘌呤碱基编辑系统、提升精确操纵目标dna序列的能力具有非常重要的意义。

技术实现思路

技术特征：

1.胞嘧啶脱氨酶用于在生物体或生物体细胞中进行基因编辑例如碱基编辑中的用途，其中所述腺嘌呤脱氨酶

2.一种碱基编辑融合蛋白，其包含核酸靶向结构域和腺嘌呤脱氨结构域，其中所述腺嘌呤脱氨结构域包含至少一个(例如一个或两个)腺嘌呤脱氨酶多肽，所述腺嘌呤脱氨酶

3.权利要求1的用途或权利要求2的碱基编辑融合蛋白，其中所述腺嘌呤脱氨酶

4.权利要求3的用途或碱基编辑融合蛋白，其中所述腺嘌呤脱氨酶在对应于seq idno:14的第106-109位的氨基酸位置处的氨基酸为vrns、alnk、alns、arnk、arns、vlnk、vlns、或vrnk。

5.权利要求4的用途或碱基编辑融合蛋白，其中所述腺嘌呤脱氨酶包含选自seq idno:2-9、11和13的氨基酸序列。

6.权利要求2-5中任一项的碱基编辑融合蛋白，其中所述核酸靶向结构域包含至少一个crispr效应蛋白(crispr effector)多肽。

7.权利要求6的碱基编辑融合蛋白，其中所述crispr效应蛋白是核酸酶失活的cas9，例如，所述核酸酶失活的cas9包含seq id no:16所示的氨基酸序列。

8.权利要求2-7中任一项的碱基编辑融合蛋白，其中所述核酸靶向结构域和所述腺嘌呤脱氨结构域通过接头融合。

9.权利要求2-8中任一项的碱基编辑融合蛋白，其中所述碱基编辑融合蛋白从n端至c端方向按以下顺序包含：腺嘌呤脱氨结构域和核酸靶向结构域。

10.权利要求2-9中任一项的碱基编辑融合蛋白，其中所述碱基编辑融合蛋白还包含一或多个核定位序列(nls)。

11.一种用于对生物体或生物体细胞的基因组中靶核酸区域进行修饰的碱基编辑系统，其包含：

12.权利要求11的碱基编辑系统，其中编码所述碱基编辑融合蛋白的核苷酸序列针对其基因组待进行修饰的生物体进行密码子优化。

13.权利要求11或12的碱基编辑系统，其中所述生物体是真核生物体，包括哺乳动物如人、小鼠、大鼠、猴、犬、猪、羊、牛、猫；家禽如鸡、鸭、鹅；植物，包括单子叶植物和双子叶植物，例如，所述植物是作物植物，包括但不限于小麦、水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、苜蓿、棉花、大麦、粟、甘蔗、番茄、烟草、木薯和马铃薯。

14.一种产生至少一个经遗传修饰的细胞的方法，包括将权利要求11-13中任一项的碱基编辑系统导入至少一个所述细胞，由此导致所述至少一个细胞中靶核酸区域内的一个或多个核苷酸，例如，所述一个或多个核苷酸取代是a至g取代，其中所述方法不包括用于改变人类的种系遗传同一性的方法。

15.权利要求14的方法，还包括从所述至少一个细胞筛选具有期望的一个或多个核苷酸取代的细胞的步骤。

16.权利要求14或15的方法，其中所述碱基编辑系统通过选自以下的方法导入细胞：磷酸钙转染、原生质融合、电穿孔、脂质体转染、微注射、病毒感染(如杆状病毒、痘苗病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒和其他病毒)、基因枪法、peg介导的原生质体转化、土壤农杆菌介导的转化。

17.权利要求14-16中任一项的方法，其中所述细胞来自哺乳动物如人、小鼠、大鼠、猴、犬、猪、羊、牛、猫；家禽如鸡、鸭、鹅；植物，包括单子叶植物和双子叶植物，优选作物植物，例如小麦、水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、苜蓿、棉花、大麦、粟、甘蔗、番茄、烟草、木薯和马铃薯。

18.一种用于治疗有需要的对象中的疾病的药物组合物，其包含权利要求11-13中任一项的碱基编辑系统，以及任选的药学可接受的载体，其中所述碱基编辑系统用于修饰与所述疾病相关的基因。

19.权利要求18的药物组合物，其中所述对象是哺乳动物，例如人。

20.权利要求18或19的药物组合物，所述疾病选自肿瘤、炎症、帕金森病、心血管疾病、阿尔茨海默病、自闭症、药物成瘾、年龄相关性黄斑变性、精神分裂症、遗传性疾病等。

21.一种获得/制备用于碱基编辑的腺嘌呤脱氨酶的方法，包括

22.权利要求21的方法，其中所述方法包括将所述包含特征序列基序vxnnx10haexnpcxmc的腺嘌呤脱氨酶中对应于seq id no:14的第106-109位的氨基酸位置处的氨基酸突变为vrns、alnk、alns、arnk、arns、vlnk、vlns、或vrnk。

技术总结
本发明涉及基因工程领域。具体而言，本发明涉及腺嘌呤脱氨酶及其在碱基编辑中的用途。更具体而言，本发明涉及一种基于新鉴定的腺嘌呤脱氨酶的碱基编辑系统，使用该碱基编辑系统对生物体(例如植物)基因组中的靶序列进行碱基编辑的方法，以及通过所述方法产生的经遗传修饰的生物体(例如植物)及其后代。

技术研发人员：高彩霞,林秋鹏,黄佳颖,K·T·赵
受保护的技术使用者：中国科学院遗传与发育生物学研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15