基于3D培养的人鼻黏膜间充质干细胞批量诱导分化为神经干细胞的方法

本发明属于细胞生物学，涉及基于3d培养的人鼻黏膜间充质干细胞批量诱导分化为神经干细胞的方法。本发明涉及经神经干细胞和其制备方法及其批量生产。本研究解决了神经干细胞在医学应用中来源受伦理学影响、相对获取困难的问题，同时提升了神经干细胞诱导异质性和产量低的问题，可以用于帕金森病及其他神经系统疾病的防治。

背景技术：

1、神经退行性疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈症和肌萎缩性侧索硬化症，是高度致残且最终致命的疾病，影响全球数百万人，发病率和患病率不断上升。但目前尚无治愈性疗法可用于阻止或逆转其进展。因此，迫切需要有效的治疗方法。神经干细胞移植已被研究为一种潜在的治疗方法，因为它有可能在中枢神经系统内作为“种子”细胞，能够在哺乳动物中枢神经系统发育过程中自我更新并产生神经元和神经胶质细胞，并且通过不同的机制改善神经损伤。因此，如何获取大量且性能稳定的神经干细胞是影响治疗效果的先决条件。

2、王东梅等在间充质干细胞治疗的安全性及伦理问题探讨中表明用于诱导神经干细胞的细胞(人类胚胎干细胞和人类诱导的多能干细胞等)多涉及伦理和安全性问题(王东梅.间充质干细胞治疗的安全性及伦理问题探讨[j].组织工程与重建外科杂志,2014,10(5):4.)。同时邢衢等研究表明不同的诱导分化方式对神经干细胞的产生有很大影响(邢衢,马珊珊,王欣欣,等.人脐带间充质干细胞神经分化微环境的优化[j].郑州大学学报：医学版,2016(4):6.)。用于神经干细胞诱导分化的细胞使用细胞培养皿逐次传代的方式，单次诱导细胞数量少，多次诱导代次不一致等很难批量稳定生产。因此，急需找到一种取材方便细胞来源和一种批量稳定诱导分化的方式。

3、人鼻黏膜间充质干细胞可通过自体鼻黏膜组织的培养获取，取材方便并且可以自体细胞诱导后移植，可避免胚胎干细胞或者人类胎儿脑源性神经干细胞/祖细胞所涉及的伦理问题。同时与其他常见种类的间充质干细胞(如骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞)相比，已有研究表明人鼻黏膜间充质干细胞具有更强的增殖能力，且更容易诱导分化为神经干细胞，是治疗神经性疾病的较好的干细胞来源(afizadeh,rafiehbagher,zohrehkamrava,seyed kamranfalah,masoumehhamidabadi,hatefghasemiboroujeni,mahdieskandarianmohammadi,fatemehkhodaverdi,sepidehzare-sadeghi,arasholya,artakomeili,ali.differentiationofhuman mesenchymalstemcells(msc)todopaminergicneurons:acomparisonbetweenwharton'sjelly andolfactorymucosaassourcesofmscs[j].journalofchemicalneuroanatomy,2019,96.)。

4、同时，为了克服神经干细胞产量低的问题，我们的研究采取3d培养的方式进行人鼻黏膜间充质干细胞向神经干细胞诱导分化过程。本发明提供一种基于3d培养的人鼻黏膜间充质干细胞批量诱导分化为神经干细胞的方法。细胞培养板中培养的干细胞由于培养皿空间限制需要频繁传代，易导致细胞老化。而3d培养系统使用3d微载体作为细胞生长的载体，既能模拟体内原生3d细胞微环境，还可通过大大增加细胞生长空间而减少传代次数，避免细胞老化，减少细胞异质性，获得大量且更均质和稳定的神经干细胞，从而实现神经干细胞稳定批量获取的目的。

技术实现思路

1、本发明的第一个内容是提供人鼻黏膜间充质干细胞的原代培养。

2、本发明的第二个内容是提供神经干细胞的诱导分化方法，该方法包括：

3、1.人鼻黏膜间充质干细胞诱导分化为神经干细胞；

4、2.诱导后的神经干细胞进行多向分化鉴定。

5、本发明的第三个内容是基于3d培养的人鼻黏膜间充质干细胞诱导分化为神经干细胞的批量生产。

6、本发明采用以下技术方案：

7、基于3d培养的人鼻黏膜间充质干细胞批量诱导分化为神经干细胞的方法，该方法包括以下步骤：

8、(1)将人鼻息肉作为组织来源获得人鼻黏膜间充质干细胞；

9、(2)将所述的人鼻黏膜间充质干细胞进行3d培养，批量诱导分化为神经干细胞。

10、优选地，诱导分化过程使用3d培养的方法进行。

11、进一步地，步骤(1)中，所述将人鼻息肉作为组织来源获得人鼻黏膜间充质干细胞包括：清洗鼻息肉，去除粘液和血丝，将鼻息肉切成多个1～2mm组织块，置于培养皿中，在每个组织块用少量完全培养基浸润；2h后将培养皿中的组织块完全浸没完全培养基中，36～37℃的培养箱中放置10～12小时，随后每两天更换培养基；再过6～7天细胞开始从组织块中生长出来并侵入培养皿，当达到80～90％汇合时使用胰蛋白酶-edta溶液消化将细胞离心分离收取细胞，即获得p0代人鼻黏膜间充质干细胞。

12、进一步地，步骤(1)中，所述完全培养基的制备方法如下：将青霉素、链霉素、两性霉素b和胎牛血清加到dmem/f12中，制得所述完全培养基，完全培养基中：胎牛血清浓度为9～10％体积比，青霉素浓度为90iu/ml～100iu/ml，链霉素的浓度为90iu/ml～100iu/ml，两性霉素b浓度为0.23～0.25μg/ml。

13、进一步地，步骤(2)中，将所述的人鼻黏膜间充质干细胞进行3d培养，批量诱导分化为神经干细胞包括：将步骤(1)中所得的p0代人鼻黏膜间充质干细胞接种到含有神经基础培养基和微载体的3d生物反应器中进行动态培养，所述的p0代人鼻黏膜间充质干细胞经神经基础培养基诱导分化，得到神经干细胞。

14、优选地，设置3d生物反应器的搅拌器的速度为第一天33～35rpm/min匀速搅拌5～6分钟暂停2～3小时，第二天搅拌器的速度为恒速40～45rpm/min，第三天至第14天搅拌器的速度为恒速50～55rpm/min，细胞在5体积％co2余量95体积％的空气的培养箱中于36.5～37°c下培养。

15、进一步地，步骤(2)中，神经基础培养基的加入量为50～200ml，微载体的加入量为5～10片(20mg/片)，细胞接种密度为4.5×105～5×105个细胞/片微载体。

16、进一步地，步骤(2)中，神经基础培养基包含1％体积比glutamaxtm(200mml-丙氨酰-l-谷氨酰胺二肽)、2％体积比50×b-27(50×神经细胞培养无血清添加剂)和10ng/mlbfgf(成纤维细胞生长因子)。

17、进一步地，所述方法还包括步骤(3)，将步骤(2)得到的神经干细胞进行多向分化鉴定。

18、进一步地，所述步骤(3)包括：将步骤(2)中得到的神经干细胞在神经元分化培养基中培养21～23天后分化为神经元和神经胶质细胞，然后进行神经胶质细胞标志物gfap和神经元标志物th的鉴定。

19、进一步地，所述步骤(3)中，神经元分化培养基制备方法如下：将dmem/f12培养基和神经基础培养基的体积比1:1混合得到混合物，向所述混合物中加入胎牛血清(fetalbovineserum，fbs)(gibco,10091148)、n2补充剂gibco，17502001)、b27补充剂(gibco，17504044)和100×青霉素/链霉素/谷氨酰胺(索莱宝，p1400)。

20、进一步地，所述步骤(3)中，神经元分化培养基中，胎牛血清浓度为9～10％体积比，n2补充剂浓度为1～1.5％体积比，b27补充剂浓度为2～2.5％体积比，青霉素浓度为90iu/ml～100iu/ml，链霉素的浓度为90iu/ml～100iu/ml。

21、本发明的有益效果是：

22、本发明所述的方法避免了由胚胎干细胞等诱导来源产生的伦理问题，同时本发明的细胞来源更易向神经干细胞分化；本发明的方法弥补了诱导分化的神经干细胞质量差、数量低的缺点，实现了诱导分化的神经干细胞的批量稳定扩增。