CEACAM5靶向的CAR-T细胞的制备方法及应用

本发明涉及生物技术和免疫治疗领域，更具体地说，涉及一种ceacam5靶向的car-t细胞及其制备和应用。

背景技术：

1、结直肠癌（colorectal cancer, crc）是最常见的恶性肿瘤之一，是全球癌症死亡的主要原因之一。有近25%的患者在首次就诊时就处于ⅳ期状态，另有25-50%的患者虽然表现为早期疾病，但仍旧继续发展为转移性crc。转移性crc的预后仍然很差，美国和欧洲的5年中位生存率仅为18.5%。crc的标准常规治疗方法是手术、化疗和放疗。嵌合抗原受体t（chimeric antigen receptor t-cell, car-t）细胞是crc治疗的新选择之一。car-t细胞由目标抗原特异性的抗体可变片段组成，这些片段融合到t细胞上，修饰的离体car-t细胞被重新注入患者体内并与靶抗原识别，实现到肿瘤部位的主动运输，并进一步体内扩增和长期持续存在，这种以主要组织相容性复合体非依赖性方式识别通过加cd28或4-1bb等共刺激结构域激活t细胞内部的信号通路，通过释放颗粒酶b、穿孔素、il-2、ifn-γ等细胞因子以促进细胞毒性和肿瘤细胞凋亡。

2、实体瘤的car-t细胞疗法仍面临许多挑战。其中一个重要的问题是实体瘤中缺乏合适的car-t细胞靶抗原，在大多数人中，靶抗原也存在于健康组织中，导致非靶向毒性。癌胚抗原细胞粘附分子5（carcinoembryonic antigen cell adhesion molecule 5,ceacam5），也被称为cd66e或癌胚抗原（cea），是属于cea家族的高糖基化膜结合糖蛋白。ceacam5长期以来一直被认为是一个有吸引力的结直肠癌靶点，因为它几乎只在结直肠肿瘤中以高抗原密度的形式高度表达，而在正常组织中表达有限。研究表明ceacam5在超过80%的结直肠癌中表达。这使得ceacam5成为针对crc的新疗法的有希望的靶点。因此开发靶向ceacam5的car-t细胞对于提高晚期crc患者的免疫治疗效果具有巨大的应用前景。

3、car由细胞外区、铰链区、跨膜区和细胞内信号区四个组成部分构成。细胞外结构域具有灵活的剪接功能并决定抗原特异性，是识别肿瘤抗原的功能部件。car的靶向结构域主要基于通常是单克隆抗体的fab或单链可变片段，因其紧凑的尺寸、高亲和力和特异性而被广泛使用。相较于传统的单链抗体片段，纳米抗体在开发各种形式的car-t方面具有独特的潜力。除了其天然的高结合能力外，纳米抗体在体内免疫原性、溶解度和稳定性方面也具有更有利的结构。纳米抗体由于缺乏导致机体产生免疫原性的接头，不会使机体产生免疫原性。通常来说，纳米抗体只需要对人源化过程进行微小的序列修正。另外，单链抗体片段会导致自发性活化诱导的car-t衰竭，这种自发性活化主要与构成car的单链抗体片段部分的框架区有关。这是car-t治疗实体瘤失败的重要原因之一。此外，纳米抗体避免了可变区和恒定区之间潜在的相互作用中断和疏水斑块的暴露。这种被破坏的相互作用和疏水残基可能严重影响溶解度和稳定性。基于这些优点，纳米抗体有望成为car-t设计中有潜力新选择。

4、基于以上背景，我们利用ceacam5靶向纳米抗体的序列，研发了靶向crc特异性靶点ceacam5的car-t细胞，并在细胞层面和小鼠肿瘤模型中评估了其抗肿瘤活性。

技术实现思路

1、本发明提供一种靶向ceacam5阳性细胞的car-t细胞的制备和应用，该car-t细胞能够表达靶向ceacam5的嵌合抗原受体，特异性的识别和杀伤ceacam5高表达的肿瘤细胞，适用于crc的治疗。

2、具体地，本发明的内容包括：

3、第一方面，本发明提供一种靶向ceacam5的纳米抗体的基因序列，具有的核苷酸序列如seq id no:2所示。

4、第二方面，本发明还提供一种car质粒，包括第一方面所述靶向ceacam5的纳米抗体的基因序列（称为nb41），能够表达靶向ceacam5的嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体包括靶向ceacam5的信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域、胞内共刺激结构域和胞内结构域。

5、进一步地，所述信号肽选自cd8 leader的结构域，具的核苷酸序列如seq id no:1所示。

6、进一步地，所述跨膜结构域选自cd8 linker和cd8 tm结构域，具的核苷酸序列如seq id no:3所示。

7、进一步地，所述胞内共刺激结构域选自4-1bb的胞内共刺激结构域，具有的核苷酸序列如seq id no:4所示。

8、进一步地，所述胞内结构域选自cd3ζ的胞内结构域，具有的核苷酸序列如seq idno:5所示。

9、第三方面，本发明还提供一种car-t慢病毒，包括第二方面所述car载体。

10、第四方面，本发明还提供了一种car-t细胞，表达如第一方面所述的car基因，根据ceacam5的抗原结合结构域和ceacam5的特异性相互作用，设计了一种car-t细胞，该细胞能够靶向并杀灭ceacam5高表达的肿瘤细胞，并用于crc的免疫治疗，提高治疗效果，crt细胞治疗后，小鼠的生存时间明显延长（观察至第24天）。

11、第五方面，本发明还提供了一种治疗结直肠癌的方法，包括给需要治疗的对象施用适量的本发明第二、三、四方面所述的质粒、病毒、细胞。

12、表1 结构域 序列 cd8 leader atggccctgcccgtgaccgccctgctgctgcccctggccctgctgctgcacgccgccagaccc nb41 cagttgcagctcgtggagtctggtggaggcttggtgcaggctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggaagcctcttcaggatcaatgccatggcctggttccgccaggctccagggaagcagcgcgagttggtcgcagctattactagtgctggtagtacaaactatgcagatttcgtgaagggccgattcaccatctccgcagacaacgccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacacagccgtctattactgtaatacaccctggcccgtagggagggactactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctcagaacccaagacaccaaaaccacaacca cd8 linker & tm accacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgc 4-1bb aaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaa cd3ζ agagtgaagttcagcagaagcgccgacgcccccgcctaccagcagggccagaaccagctgtacaacgagctgaacctgggcagaagagaggagtacgacgtgctggacaagagaagaggcagagaccccgagatgggcggcaagccccagagaagaaagaacccccaggagggcctgtacaacgagctgcagaaggacaagatggccgaggcctacagcgagatcggcatgaagggcgagagaagaagaggcaagggccacgacggcctgtaccagggcctgagcaccgccaccaaggacacctacgacgccctgcacatgcaggccctgccccccaga